识别特异性酪氨酸磷酸化多肽抗体的制备

基 本 方 案 1 多克隆抗磷酸肽抗体的制备

材料

B S A -琼 脂 糖 亲 和 基 质（Sigma) 填 装（如辅助方案 2 ) 于柱床体积IOml的层析柱

磷酸化酪氨酸亲和基质层析柱（IOml 柱床体积；见辅助方案3)

磷酸肽-B S A 偶联物免疫家兔的粗制血清

PB S /叠氮钠.•含有0.02% (m /V ) 叠氮 钠 的 PBS (附 录 1 ) ( 可长期保存于4°C 或室温）

3m ol/L NaSCN

同种非磷酸肽亲和基质层析柱（3m l 柱床体积；见辅助方案1 和 2)

同源磷酸肽亲和基质层析柱（可选； 3m l 柱床体积；见辅助方案1 和 2)

阳性选择的磷酸肽亲和基质层析柱（3m l 柱床体积；见辅助方案1 和 2)

3.5m ol/L 和 4. 5m ol/L MgCl2 (可选）

透 析 袋（M W C O 12 000〜14 0 0 0 ; 宽 10m m ，直径 6. 4m m ; 如 Spectrum 的 Spectra/Por 4)

注 ：所有以下的层析步骤均在室温下进行，液体均以重力作用上柱。

1 . 将洗涤后的B S A -琼脂糖与磷酸酪氨酸亲和基质层析柱相连。

2 . 将 15m l 的粗制血清通过重力作用流过两柱，以 PBS/叠氮钠洗，直到所有黄色血清均 通 过 层 析 柱（或以分光光度计测流出液的A 28。吸光度，直至达到基线）。再 以 5〜IOml P B S /叠氮钠洗柱，收集所有穿出液，其中可能含有目的抗体。

每 一 次 过 柱 后 血 清 的 体 积 会 增 加 ， 这 将 延 长 下 一 次 过 柱 的 时 间 。 如 果 通 过 观 察血 清 的 黄 色 程 度 来 确 定 液 体 流 穿 的 进 程 ， 则 血 清 越 被 稀 释 后 就 越 不 容 易 观 察 。

3 . 可选：留取部分粗制血清组分及第一次的穿出液，用于后续分析及对比每一次纯化的组分。如果有必要，可立即通过免疫印迹对含有多种磷酸化酪氨酸蛋白的样本进行 分 析（单 元 12. 5)，以排除无反应的组分。也可以留取部分纯化的组分用于接下来的分析，然后继续下一步骤。

4 . 血清过柱后，以 1 0 倍柱床体积的3mol/L N a S C N 和 10倍柱床体积的P B S /叠氮钠再生柱子， 4°C 保 存 于 P B S /叠氮钠中备用。

5 . 将穿出的血清组分尽量多次过同种非磷酸肽亲和基质柱，以尽量减少交叉反应。以10倍柱床体积的3mol/L N a S C N 和 1 0 倍柱床体积的PBS/叠氮钠再生柱子。分析每次或多次过柱的血清或保留部分组分待以后分析。

6 . 如果预期与同源的磷酸蛋白有交叉反应，则 使 用 步 骤 5 中提供的方法使穿出的血清组分通过同源磷酸肽亲和基质柱。

7 . 在收集阳性选择亲和纯化的穿出峰之前，将 25c m 的透析袋水化并洗涤。透析袋一端用透析夹夹紧，检查是否渗漏，配 制 6L PBS/叠氮化合物， 4°C 保存用作透析液。

8 . 将上次层析步骤所得到的流穿血清通过阳性选择的磷酸肽亲和基质柱3 次（使抗体亲和基质的相互作用最大化），在每次之间不需洗柱。

9 . 收集最后一次穿出的血清，用 5〜20m l 的 P B S /叠 氮 钠 洗 柱（根据柱前体积和柱床体积），将洗涤物与流穿的血清合并，另 用 20m l 的 P BS/叠氮钠洗柱，收集流穿液体作为 「洗涤」峰 。

10.以多种促溶剂洗脱：可 以 选 用 20m l 3mol/LNaSCN (最佳选择）或 10m l 3.5mol/LMgCl2 (可能会产生沉淀，减慢流速）洗脱后加I O m U .5mol/L MgCl2洗脱。开始洗脱时，立即收集每份3m l 洗脱液到步骤7 中准备的透析袋中，用透析夹将近端的袋口夹紧并立即投入PBS/叠氮钠透析液中。或者也可以收集3m l 洗脱液到透析管中，一旦收集每一组分完毕，立即将透析液加人透析管中。收集至少6 个 组 分（大多数抗体在前 3 个组分中， 2〜3 个柱床体积），如前所述再生柱子（步 骤 4)。

11.在 P B S /叠氮钠中于4°C 对 步 骤 1 0 收集的所有组分进行彻底透析。

12.检 测 280n m 吸光度或用蛋白比色法测定透析后组分的蛋白质浓度，并 计 算 产 量（15 ml血清得到> l m g 纯化抗体）。分装抗体保存于一70°C ，正在使用的抗体保存于4°C 。

13.用 ELISA (单元L I ) 或 免 疫 印 迹（单 元 12. 5 ) 分析最终样本以及以前步骤中保存的纯化组分的反应性和交叉反应性。

基 本 方 案 2 制备抗磷酸肽的单克隆抗体

材 料（带V 项 目 见 附 录 1)

融合后的候选杂交瘤细胞系（单 元 1.3)

D M E M /H T 完全培养基

筛选稀释液

同种磷酸肽-B S A 偶 联 物（作 为 E L I S A 抗原；辅助方案1 和 单 元 13. 1、单 元 13. 3)

阴性对照：用于制备杂交瘤细胞系小鼠的免疫前血清

阳性对照：用于制备杂交瘤细胞系小鼠的免疫血清

同种非磷酸酪氨酰基肽-B S A 偶 联 物（作 为 E L I S A 抗 原 ；单 元 13.1、单 元 13.3)

非同种磷酸酪氨酰基肽-B S A 偶 联 物（作 为 E L IS A 抗原 ；单 元 13.1、 单 元 13. 3)

B S A 偶联的同源磷酸肽（可选；作 为 E L IS A 抗原；单 元 13.1、 单 元 13. 3)

9 6 孔聚苯乙烯组织培养板

网格记录纸

1 . 用 H T 培养基将融合的候选杂交瘤细胞系以低密度（目的是达到每3 个 孔 1 个细胞）接 种 于 9 6 孔聚苯乙烯组织培养板（单 元 1.3)， 2 周左右测定，通 过 记 录 9 6 个网格记录纸上每个孔上的克隆数目来鉴定所有单克隆杂交瘤培养孔，作为可能的候选株，为便于鉴别，在每个含有单个克隆的孔的下方做标记。

2 . 使用无菌技术，从每个可能候选株的孔中移出等份上清（如 从 2 0 0 4 中 移 出 IOOm I)至另一个9 6 孔 板（筛选板）中，在网格记录纸上记录原始板的编号、孔的位置以及相对应板的编号、孔的位置。原始孔每孔再补加以100ul， 37°C 预热的新鲜H T 培养基 。如果需要，用亮色的孔状大小的胶贴粘贴在板盖表面以示标记。如果上清没有立即进行检测，则将筛选板塑料袋包好存放于4°C 。

3 . 筛选板中每孔上清液加入150ul 筛 选 稀 释 液（防止微生物污染并扩大体积）。

4 . 以同种非磷酸肽-B S A 偶联物为抗原进行ELISA (单 元 1.1)，对筛选板中每一候选杂交瘤上清的部分组分（如 50M1 ) 进行筛选。记录每个阳性样本筛选板的编号、孔的位置以及相对应的原始板编号、孔 的 位 置 ，同时测定融合用小鼠的免疫前血清(阴性对照）和 同 一 只 小 鼠 的 免 疫 血 清（阳性对照），在 H T 培 养 基 ：筛选稀释液1 : 1 混合液中按1 : 1 0 0 稀释 。同时也对空白筛选稀释液进行E L I S A 检 测（作为附加的阴性对照）
。
5 . 以同种非磷酸肽-B S A 偶联物为抗原，顺次或同时对步骤4 筛选出的每个阳性样本的部分组分进行ELISA (单 元 1 . 1 ) 检 测 ，以剔除非磷酸化反应性的克隆；以非同种无关磷酸酪氨酰基肽-B S A 偶联物为抗原进行 E L IS A 检 测 ，以剔除具有其他磷酸酪氨酸反应性的克隆。此外，如果预期可能与同源磷酸化蛋白有交叉反应，则 以 BSA偶联的同源磷酸肽为抗原以剔出任何可能的同源磷酸化蛋白交叉反应。如果有必要，也可以同时筛选具有非磷酸化同种肽的特异反应性的克隆。

6 . 将克隆扩大培养，以满足筛选所需的所有试验。冷冻部分组分备用。通过有限稀释(单 元 1 . 3 ) 对剩余的细胞进行亚克隆。

7 . 如 步 骤 4 和 5 , 筛选亚克隆的上清，检测抗体的持续分泌和特异性。将具有代表性的独立亚克隆与其原始的母代克隆区分开来，因为难以预测每个母代单克隆抗体是否能够识别同种磷酸化全蛋白，或者能否用于日后的各种类型免疫检测。扩大培养和冻存候选亚克隆。最好经过多轮传代和冻存、复苏、再扩大培养后，连续检测抗体的特异性和分泌持续性（推荐）。

8 . 进一步对亚克隆进行鉴定，选取最有用的克隆，分析培养上清液在特定的免疫检测(如免疫共沉淀，如 单 元 12. 2 中所述；或免疫印迹，如 单 元 12. 5 中所述）中与同种磷酸化全蛋白的反应性。

9 . 可选：将目的克隆大量培养获取培养上清制备抗体，并 进 行 亲 和 纯 化（见基本方案1)，或 制 备 腹 水（单 元 1.4)，腹水可通过硫酸铵沉淀而后进行亲和纯化。如果有必要 ，可以利用商业化的试剂盒（如 Pierce或 Sigma) 进行亚型分析。

辅 助 方 案 1 肽的合成

目前，大多数含磷酸酪氨酰基的肽是利用9-芴 甲 氧 羰 基（Fmoc) 磷酸酪氨酸合成的。由于在磷酸酪氨酸上缺乏一个侧链保护性基团（Kitas^ d . ， 1994)，标 准 F m o c 合成和裂解步骤才得以应用（Chang and Meienhofer， 1978); 然 而 ，要想达到氨基酸的有效偶联，在加入未保护的磷酸酪氨酸后，需要比标准步骤用量更高的超浓度的活化F m o c 氨基酸。在有些情况下，需要用双偶联法，即在加入磷酸酪氨酸之后再加入少量其他氨基酸以延长肽链。这种替代方法需要按合成肽的要求，有顺序地、反复加入下一个指定氨基酸。在本单元中阐述将肽偶联到亲和基质上的方法（见 辅 助 方 案 2)，将肽段偶联到载体蛋白的常用方法将在单元13. 1 和单 元 13. 3 中阐述。

辅 助 方 案 2 肽 段 偶 联 到Affi-G d 1 0 亲和性基质

此方案描述了将磷酸肽和非磷酸肽偶联到Affi-Gel 1 0 亲和性基质上的方法，用于抗体的亲和柱层析纯化。这一步骤可生成3m l 终末柱床体积的亲和性树脂，每毫升凝胶 偶 联 3umol肽 。

材料

用于偶联的合成寡肽（见辅助方案1)

二 甲 基 亚 砜（D M S O )

iV-甲 基 吗 啉（9 9 % 纯度； AcrosOrganics)

Affi-Gd 10 (Bio-Rad) 或类似活化支持基质

氨基乙醇

0.lmol/L 氨基 乙 醇 •H C 1， p H 8. 0

高盐/髙 p H 溶液••0 •5mol/L NaCl/0. 4 % (m A O 碳酸氢钠

高盐/低 p H 溶液： 0.5mol/L N a C l /100 mmol/L 乙酸钠， p H 4.2

PB S /叠氮钠：含 有 0.02% (m /V ) 叠氮钠的PBS (附录1)

0.5mol/L NaCl

3mol/L NaSCN

聚丙烯螺旋盖离心管

直 立 圆 筒（end-over-end) 摇床

真空吸引器

玻璃层析柱，容量> 5 ml (Bio-Rad) ，或 带 有 1-cc硅 化 玻 璃 棉 塞 子 的 5m l 塑料注射器

1 . 将 合 成 寡 肽 按 0.5〜4 倍 所 需 柱 床 体 积 的 容 量 比 溶 解 于 D M S O 。例 如 ， 9 Mm o l 肽(15. 3m g ，对于一个平均15m e r 分子质量为1700的肽）对 应 3m l 柱床体积。

2 . 按如下操作小心滴定以中和肽溶液：以 1〜2ul增量加入肽合成级N -甲基对氧氮己环(高浓度或在D M S O 中稀释到1 : 1 〜1 : 9 ) ，每次加入后移出 2〜3ul等 份 ，将其用50ul水稀释，然后点在 p H 试纸条上。重复这一步骤，直 到 p H 达 到 7〜8 (基本上每 3 umol肽 需 要 7〜8ul，取决于氨基酸序列）

3 . 充分混匀 Affi-Gd 1 0 亲和性基质瓶中的内容物，使树脂悬浮，然后将所需体积的树脂[2 倍 于 柱 体 积（4 倍 于 5 0 % 混 悬 物）的 树 脂 ] 移 至 聚 丙 烯 螺 旋 盖 离 心 管 ，在D M S O 中 洗 3 次 ，每次在室温下以700 g 转 速 离 心 5 min。吸出上清液，以 5 倍体积D M S O 重悬树脂，然后再次以700 g 转速离心。不要超过推荐的转速进行离心，否则可能破坏树脂。

4 . 从树脂中吸出过量的D M S O , 加 入 步 骤 2 制备好的肽溶液，在室温下用直立圆筒振荡器孵育过夜。每 毫 升 树 脂 加 入 纯 氨 基 乙 醇（消除未反应的酯基团），在室温下用直立圆筒摇床孵育2 h ，如 步 骤 3 在 D M S O 中洗 2 次 。

5 . 如 步 骤 3 在 p H 8. 0 的 0. lmol/L氨 基 乙 醇 •H C l 中 洗 2 次（第 1 次要在冰上进行，因为会产生大量热量），第 2 次洗涤后移出O.lmol/L氨 基 乙 醇 ^ H C l , 更换新溶液，在 4°C 下用直立圆筒摇床孵育过夜，然后低速离心并吸出上清液。

6 . 利用步骤3 中描述的方法，用高盐/高 p H 溶 液 洗 3 次 、高盐/低 p H 溶 液 洗 3 次 、P BS /叠氮钠洗3 次 ，洗涤后的树脂保存于4°C ，直至装于层析柱。

7 . 用 O.5mol/L N a C l 将基质混合为混悬物，然后灌入玻璃层析柱或带有1-cc硅化玻璃棉塞子的5m l 塑料注射器底部，先 后 用 1 0 倍 于柱体积的3m d / L N a S C N 和 1 0 倍于柱体积的P B S /叠氮钠洗涤每个层析柱。

辅 助 方 案 3 磷 酸 酪 氨酸 偶 联到Affi-G d 1 0 亲和基质

此步骤可生成IOml终末柱床体积的亲和性树脂，每毫 升 Affi-Gd 1 0 偶 联 3 umol 磷酸酪氨酸。

材料

磷酸酪氨酸

0.4% (m /V ) 碳酸氢钠

lmol/L N a O H (可选）

氨基乙醇

0 •lmol/L 氨 基 乙 醇 •H C 1， p H 8. O

烧结玻璃漏斗和真空吸引器

玻璃层析柱，容量> 1 4 ml (Bio-Rad)

1 . 将磷酸酪氨酸按 0.5〜4 倍的预期柱床体积的容量比溶解于 0 . 4 % 碳酸氢钠。例如 ，30umol 磷 酸 酪 氨 酸（7.8m g ，对于相对分子质量为 2 6 1 的磷酸酪氨酸）对 应 IOml柱床体积。如果简便些，可以多用些磷酸酪氨酸，因为它相对比较便宜。

2 . 用 p H 试纸条测定 p H 达 到 7〜8。如果有必要调整，可通过滴定来中和溶液，如加入 少 量 l m d /L N a O H ，每次加入后移出2〜3jlJ 等份 ，然后点在p H 试纸条上。重复这一步骤直到 p H 达 到 7〜8。

3 . 充分混匀Affi-Gel 1 0 亲和基质瓶中的内容物，使树脂悬浮，然后将所需体积的树脂[2倍 于 柱 体 积（4 倍 于 5 0 % 混悬物）的树脂]移至连接真空抽吸器的玻璃陶瓷漏斗。洗 3 次 ，每次向树脂上灌入冷蒸馏水后进行抽吸，然后以同样方法用冰冷的 0 . 4 % 碳酸氢钠洗涤最后一次。

4 . 用真空抽吸从凝胶中吸出大部分多余的液体，不必使其完全干燥，将其移至螺旋帽离心管，加入步骤 2 备好的磷酸酪氨酸溶液，树 脂 从 瓶 中 移 出（步 骤 3 ) 到与磷酸酪氨酸溶液混合的时间间隔不要超过 20min。在 4°C 下用直立圆筒摇床孵育过夜。

5 . 每毫升树脂加入 2ul 纯 氨 基 乙 醇（消除未反应的酯基团），在室温下用直立圆筒振荡器 孵 育 2 h 。洗树 脂 2 次 ，每 次 低 速 离 心（见辅助方案2 , 步 骤 3 ) 并吸出上清液，以5 倍 体 积 0 . 4 % 碳酸氢钠重悬树脂，然后再次低速离心。

6 . 如 步 骤 4 在 p H 8. 0 的 0. lmol/L 氨 基 乙 醇 •H C l 中 洗 2 次 ，第 2 次洗涤后移出0.lmol/L 氨 基 乙 醇 . H C l ，更换新溶液，在 4°C 下用直立圆筒摇床孵育过夜，然后低速离心并吸出上清液。洗涤 、保存、填 装 树 脂 于 层 析 柱 中（见 辅 助 方 案 2 , 步骤
7)。