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单克隆细胞培养上清的大规模制备

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

附 加 材 料(其他材料见基本方案 1)

含有 5〜10 mmol/L HEPES 的 DMEM 完全培养基和 DMEM-IO 完 全 培 养 基(附录1) , pH 为 7. 2〜7.4

7 0 % (VAO 乙醇FBS

1 0 % (m A O 叠氮钠,可选的

850 cm2 滚筒式培养瓶和滚筒装置, 37°C

250 ml 塑料锥底离心管,无菌

Beckman 离心机和 JS-5. 2 转 子(或同等设备)

0.45 um 过滤装置,可选的

1.增 殖 杂 交 瘤(见基本方案 1 ,步 骤 1),以 1 : 1 0 的比例分离部分细胞到装有 DMEM-10/ 5〜10 mmol/L HEPES 培养基的 175 cm2 培 养 瓶 中(使培养液总共 100 ml)。为了用 蛋 白 A-亲和色谱法纯化 MAb, 需单独检测有 FBS 的 培 养 基 以 排 除 污 染(可能会与 MAb —起被纯化出的杂蛋白)。如果需要,则在无血清培养基中培养细胞。

2.当细胞已达到分离移种标准(一 般 为 IXlO6〜2 X 106 个细胞/ ml) 时 ,将培养瓶内容物转移到 850 cm2 滚筒式培养瓶中。加 入 150 mlDMEM-10 完全/ HEPES 培养基(使培养液总量达到 250 ml)。塞紧瓶塞,置于滚筒装置,于恒温室或培养箱 37°C 恒温 培 养 1〜2d。

3.用 浸 有 7 0 % 乙 醇 的 纱 布 擦 拭 培 养 瓶 口 和 瓶 颈 。打 开 培 养 瓶 ,加 入 250m l 含有HEPES 培 养 基 的 DMEM-IO 完 全 培 养 液(使 培 养 液 总 量 达 到 500 ml)。塞 紧 瓶 塞 ,置于滚筒装置, 37°C 恒温培养 1〜2d。

4.擦拭瓶口,打幵培养瓶,加 入 2L 含 有 HEPES 的 DMEM-IO 完 全 培 养 液(使培养液总 量 达 到 2500 ml) ,基 本 装 满 整 个 培 养 瓶 。为 防 止 起 泡 ,先 加 入 培 养 基 ,后加入FBS 至培养液总量的 1 0 % 。塞紧瓶塞,置于滚筒装置, 37°C 恒温培养至培养基变黄
(大约需要 5d; 不要过长时间滚动培养瓶,以免细胞发生破碎)。

5.将培养液倒入 250 ml 锥底离心管。室温下, 250 g 离 心 20 min。取上清,弃沉淀。若不进行培养上清的生物学检测,则 加 入 1 0 % 的叠氮钠溶液至总量的 0 . 0 2 % 。若需对培养上清进行亲和色谱或盐析纯化,先 用 0• 45um过滤装置过滤培养上清。将培养上清分装后冰冻储存。

来源:丁香实验

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