单克隆细胞培养上清的大规模制备

附 加 材 料（其他材料见基本方案 1)

含有 5〜10 mmol/L HEPES 的 DMEM 完全培养基和 DMEM-IO 完 全 培 养 基（附录1) ， pH 为 7. 2〜7.4

7 0 % (VAO 乙醇FBS

1 0 % (m A O 叠氮钠，可选的

850 cm² 滚筒式培养瓶和滚筒装置， 37°C

250 ml 塑料锥底离心管，无菌

Beckman 离心机和 JS-5. 2 转 子（或同等设备）

0.45 um 过滤装置，可选的

1.增 殖 杂 交 瘤（见基本方案 1 ，步 骤 1)，以 1 : 1 0 的比例分离部分细胞到装有 DMEM-10/ 5〜10 mmol/L HEPES 培养基的 175 cm2 培 养 瓶 中（使培养液总共 100 ml)。为了用 蛋 白 A-亲和色谱法纯化 MAb， 需单独检测有 FBS 的 培 养 基 以 排 除 污 染（可能会与 MAb —起被纯化出的杂蛋白）。如果需要，则在无血清培养基中培养细胞。

2.当细胞已达到分离移种标准（一 般 为 IXlO6〜2 X 106 个细胞/ ml) 时 ，将培养瓶内容物转移到 850 cm2 滚筒式培养瓶中。加 入 150 mlDMEM-10 完全/ HEPES 培养基(使培养液总量达到 250 ml)。塞紧瓶塞，置于滚筒装置，于恒温室或培养箱 37°C 恒温 培 养 1〜2d。

3.用 浸 有 7 0 % 乙 醇 的 纱 布 擦 拭 培 养 瓶 口 和 瓶 颈 。打 开 培 养 瓶 ，加 入 250m l 含有HEPES 培 养 基 的 DMEM-IO 完 全 培 养 液（使 培 养 液 总 量 达 到 500 ml)。塞 紧 瓶 塞 ，置于滚筒装置， 37°C 恒温培养 1〜2d。

4.擦拭瓶口，打幵培养瓶，加 入 2L 含 有 HEPES 的 DMEM-IO 完 全 培 养 液（使培养液总 量 达 到 2500 ml) ，基 本 装 满 整 个 培 养 瓶 。为 防 止 起 泡 ，先 加 入 培 养 基 ，后加入FBS 至培养液总量的 1 0 % 。塞紧瓶塞，置于滚筒装置， 37°C 恒温培养至培养基变黄
(大约需要 5d; 不要过长时间滚动培养瓶，以免细胞发生破碎）。

5.将培养液倒入 250 ml 锥底离心管。室温下， 250 g 离 心 20 min。取上清，弃沉淀。若不进行培养上清的生物学检测，则 加 入 1 0 % 的叠氮钠溶液至总量的 0 . 0 2 % 。若需对培养上清进行亲和色谱或盐析纯化，先 用 0• 45um过滤装置过滤培养上清。将培养上清分装后冰冻储存。