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直 接 细 胞 ELISA 法检测细胞表面抗原

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

直 接 细 胞 ELISA 法检测细胞表面抗原
在测定单一细胞群体的抗原表达水平时,该 检 测 过 程(图 1.1. 5 ) 与流式细胞分析一 样 灵 敏(单 元 4.1、单 元 4. 2)。但在检测混合细胞时,敏感性不及流式细胞分析。用生物素化的抗体替代酶标抗体,就可转化为间接方法,而后加入亲和素标记的碱性磷酸酶再次孵育可增加敏感性。

附 加 材 料(其他材料见基本方案1)

细胞样品

碱性磷酸酶标记的特异性抗体

冰冷的洗涤缓冲液

2 5 % (m/V) 戊 二 醛(EM 级 ; Sigma) ,可选用PBSLE: PBS (附录 1),力口 l 〇 0 mmol/L 赖 氣 酸 或 100 mmol/L 乙醇胺,可选用锥底或圆底微量滴定板

1.使用不同数量的阳性和阴性对照细胞样品和不同浓度碱性磷酸酶标记抗体,十字交叉连续稀释分析法确定每孔添加的最适细胞数和酶标抗体最适浓度(见辅助方案)。
图1.1. 5 直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原。 Ab,抗体; C, 细 胞; E,酶。 开始时以每孔I XIO5〜5 X IO5 个细胞和0 •5〜IOiUgAnl酶标抗体滴定。 预试验中仅加入底物孵育,检测待测细胞本身是否表达碱性磷酸酶。如果表达 量较大,影响酶标抗体的敏感性,则用另一种酶标记复合物,如 P -半乳糖苷酶。 2 . 使用台式离心机,将细胞样品加入15m l或 50m l离心管, 4°C , 450g 离 心 5min。计 数 细 胞 量 (附 录 3A),并用冰冷的洗涤缓冲液重新将细胞混勻,配 制 成IXIO6〜5 X IO6 个细胞/ml (步骤3)。 3 . 可选:用 0.5 % (W V ) 戊 二 醛 (终浓度)固定细胞并混匀,室温下孵育30min。离 心沉淀细胞,去上清液,用 PBSLE重新悬浮 细 胞 , 37°C 下 孵 育 30miri。用 PBSLE 洗 涤 2 次并用洗涤缓冲液重新混匀。如需要,可 4°C下储存细胞数月。 如固定后细胞表面抗原仍保持其抗原性,可在实验开始时就固定细胞。 4 •将1 0 0/xl细 胞 悬 液 ( I X l O 5 〜 5 X 1 0 5 个 细 胞 )加 入 锥 底 或 圆 底 微 量 滴 定 板 孔 中 , 4°C , 450g 离 心 lmin。真空吸去上清液,将微量滴定板置于振荡器或微量滴定板摇 床上,悬浮沉淀物。 5 . 用IOOju I 最适浓度的酶标抗体(步 骤 1 ) , 在冰冷洗涤缓冲液中重新混匀沉淀物。 4°C 下 孵 育 1.5h,每 隔 15min柔和摇动微量板重新混匀细胞,注意不要使细胞悬液溅出 孔板。 6. 4°C , 450g 离心细胞lmin,真空吸去上清液,振摇悬浮沉淀物,加 入 200^1冰冷的 洗涤缓冲液重新将其混勻,重 复 3 次。 7•加入100/xlMUP或 NPP底物溶液。室 温 下 孵 育lh ,显色过程中,每 隔 15min柔和 摇动微量板混匀细胞。 目测或使用微量滴定板检测仪(见基本方案,步 骤 9 ) 确定显 色程度

来源:丁香实验

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