直 接 竞 争ELISA 法检测可溶性抗原

直 接 竞 争ELISA 法检测可溶性抗原

该检测方法是使用特异性抗体和毫克级纯化或半纯化抗原来定性或定量测定可溶性抗原的最有效的方法（图 1.1. 2)。用抗体替换特异性的酶标抗体，就可转为间接方法，以种属特异性或同种型特异性酶结合物作为第三种试剂即可检测结合的特异性抗体的量。

附 加 材 料 （其他材料见基本方案）

碱性磷酸酶标记的特异性抗体

标准抗原溶液

待测抗原溶液： 0.2〜10ug抗原/ml，纯化或部分纯化，用 PBSN配制， 4°C下保存圆底或锥底微量滴定板

1.十字交叉连续稀释分析法确定包被试剂和碱性磷酸酶-抗体结合物的最适浓度，标准抗 原 溶 液 （包被试剂）和 结 合 物 （显色剂）浓 度 各 不 相 同 （见辅助方案）。用封闭缓冲液稀释结合物，配 制 浓 度 为 最 适 浓 度 （通 常 为 25〜500ng抗体/ml) 2 倍 （2 X )的结合物溶液。每个滴定板需3ml结合物溶液。

2.用 50ul标准抗原溶液包被Immulon微量滴定板，并 封 闭 （见基本方案，步 骤 2〜5)。

3.为了绘制标准抑制曲线（步 骤 10)，用封闭缓冲液对标准抗原溶液做连续6 次 1 : 3(V/V) 的 稀 释 （见辅助方案）。应 使 用 抑 制 作 用 动 态 范 围 大 （1 5 % 〜8 5 % ，通常是1〜250ng/ml) 的若干稀释度，每个滴定孔每个稀释度需75ul以 上 。

抑制作用动态范围在最初的实验里以经验确定，抗原浓度一般在10^-6 mol/L 和10^-12mol/L 范围内变动。对于大多数蛋白质抗原，初 始 浓 度 应 在IOiUgAnl左右，用封闭缓冲液以1 : 4 (v/v ) 连 续 稀 释 9 次，在标准检测条件下检测这些抗原稀释液抑制结合物与抗原包被滴定板结合的能力。

4.圆底或锥底微量滴定板每孔中加入75ull2 X 结合物溶液，而 后 加 入 75ul抑 制 剂 [待测抗原溶液或者是标准抗原溶液（步 骤 3)]，混合孵育。将 等 体 积 的 2 X 结合物溶液与封闭缓冲液混合配制成未抑制的对照样本，用微量移液管上下混匀3 次 后 ，于室温下孵育> 3 0 min。如需要，测定待测溶液的2〜3 个稀释度，以 期 在 1 5 % 〜8 5 % 范围内产生抑制作用。

5.转 移 50ul结合物与抑制剂的混合液或对照样本到一抗原包被的滴定板上（步 骤 2)。对照样本放在第11列 ；单 纯 底 物 溶 液 （无结合物）放 在 第 1 2 列 。如要测复份样品，则将其放入同一块板的相邻一列中。如需精确定量分析，每块板上应含有同源抗原溶液的不同稀释液（步 骤 3)，于室温下孵育2h。

6.洗 涤 滴 定 板 （见基本方案，步 骤 7)，每孔中加入75M1 MUP或 NPP底物溶液，室温下 孵 育 lh 。

7.至 少 1h 以后，无抑制反应中的底物充分显色，可用微量滴定板检测仪精确测量抑制作用。

8.基于标准抗原溶液稀释液抑制作用绘制标准抗原-抑制曲线，抗 原 浓 度 对 数 值 为 x轴 ，焚光度或吸光度为： y 轴 。

9.用内插法在标准抗原抑制曲线中求出待测溶液中抗原浓度。线性偏差表明特异性抗体是异质性的，有明显不同的亲和力，或可能是配制的标准抗原溶液含异质性抗原。