方案7 用 ESI-MS 确定丝氨酸、苏氨酸的磷酸化位点实验

一、磷酸化蛋白的还原、烷基化和消化

1.在不含 Na+、K+的试管中，用消化缓冲液 A 于 37°C 洗凝胶条 10 min。

2.用还原剂覆盖凝胶条，37°C 下作用 15 min。

3.把还原剂洗去，再加烷化剂，覆盖凝胶条，37°C 下黑暗中放 15 min。

避免长时间的放置，因为甲硫氨酸会被碘乙酰胺烷化（Sickmann，etal，2000)。

4.加 5ul β-巯基乙醇到烷化剂中，然后覆盖凝胶条，37°C 孵育 5 min 以上。

5.把液体倒掉，用消化缓冲液 A 洗凝胶条 37°C 10 min。

6.倒掉消化缓冲液 A，用消化缓冲液 B 37°C 下洗凝胶条 10 min。

7.重复⑤、⑥步两次以上。

8.室温，加乙腈使凝胶条脱水直到变白（约 3 min)。

9.加蛋白酶溶液使凝胶膨胀，37°C 下 20 min。

10.用消化缓冲液 A 覆盖凝胶条，防止其干燥。

11.37°C 下孵育过夜。

二、用于 nano-HPLC 分离的凝胶条的抽提液

12.弃掉凝胶条中的消化缓冲液，用 15ul 5% 的甲酸覆盖凝胶条，并在一个预冷的超声浴中孵育 20 min。

13.收集凝胶周围的液体，其中含有消化的多肽。

14.重复12、13 步。

三、在 nano-HPLC 过程中釆用前置柱对多肽进行浓缩

nano-HPLC 的流速一般小于 0.3 u1/min，在抽提多肽后，大约可以得到样品，对于做 nano-HPLC 来说，量太大。所以需要像图 9.20 中的那样，对多井行浓缩。此方法的一个优点是样品的在线浓缩会使加人的样品体积减小。

15.把样品加入进样环管，TFA(0.1%) 60 ul/min 下 10 min 将样品浓缩到 c18 预柱上。

16.浓缩后，把 B 阀移到 1-4 位置，进入泵流。

17.按如下方法洗脱多肽：

（1）调泵流速度为 7O ul/min(若用 ABI140D 系统）。

（2）用一个前置柱分流器调节柱流速度到 100~200nl/min。

（3）用 nano-RP-HPLC 缓冲液 A 平衡 75um (内径）柱子 10 min。

（4）用 5%~50% 梯度的 nano-RP-HPLC 缓冲液 B 洗脱多肽 90 min 以上。

四、LC-MS/MS 分析

18.用纳喷离子源和 micro-ESI 接口把多肽加样到 ESI 质谱仪中。

19.用三重扫描过程（全扫描、第一次数据依赖型 MS/MS 扫描、第二次数据依赖型 MS/MS 扫描），记录 MS 谱图，每一次扫描都持续 2s。

五。用 SEQUEST 法则进行数据自动化分析

20.用 SEQUEST 软件自动处理 LC-MS/MS 的原始数据文件。