胚 胎 肝 脏 干 细 胞 的 分 离 培 养 扩 增 与 定 向 诱 导 分 化

胚 胎 肝 脏 干 细 胞 的 分 离 培 养 扩 增 与 定 向 诱 导 分 化

与成熟的肝脏、胰腺和唾液腺相比，胎肝脏中干/祖细胞比例更高，更为原始，具有更弹的增殖分化潜能，免疫原性相对较弱。 Malhi等(2002)从 17——24周孕龄的人胎肝中分离出的大量上皮祖细胞具有很强的克隆形成和增殖能力，体 外 传 4 0 代以上仍保持正常核型 ，表达卵圆细胞特有的表面标志，将原代培养及体外扩增的细胞移植入CCl4损伤的重症联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency, SCID)小鼠体内后，能整合入受体肝脏实质，并且可向成熟肝脏细胞分化。用 FACS方法从孕龄13.5天的小鼠胎肝脏中分选 出 的 C-Met+CD4^ 7 k5 wC-Idr CD45— TER119— 细胞具有高度的自我更新和多向分化潜能，当细胞分别经脾、胆总管及十二指肠壁移植入受体小鼠后，该种细胞可分别向肝脏细胞、胰腺上皮细胞和肠上皮细胞分化 (Suzuki et al. 2002)。

以大鼠胎肝细胞的分离培养为例，此 外 用 0 X43/44 抗体免疫吸附法去除胎肝中的造血干细胞(徐 国 权 2001)，获得较为纯化的胎肝细胞，并对纯化后的胎肝细胞在体外进行培养扩增与定向诱导分化。

实 验 所 需 仪 器 及 材 料

(1)纯 系 S D 大鼠一 ——成年雄性大鼠(体重200±20 g)及 孕 15、 18、 2 0 天成年雌性大鼠。
⑵ 主 要 试 剂 ： I 型胶原酶，小鼠抗大鼠OX43/OX44 抗 体 ，羊抗
小 鼠 I g G 血清， D M E M 培养基、 F 12培养基，兔抗大鼠白蛋白单抗，胎牛血清，淋巴细胞 分 离 液 (P= 1.〇83)， HEPES， 胰 高 血 糖 素 (glucagon) , 胰岛 素 (insulin)，氢化可的松(hydrocortisone) , 转铁蛋白(transferrin) , 表皮生长因子 (epidermal growth factor) , 砸酸盐
(sodium selenate) ，尼 克 駄 胺 (nicotin-amide) ，亚 油 酸 (linoleic acid) ， 醋 酸 维 生 素
E (a-toC〇 pher 〇lacetate)，维生素 C ，甘氨酸(glycine) , 甲状腺素(triidothyronine， T 3)等。

(3) —次性无菌离心管，细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶等。

方法

1 ) 孕 周 确 定 方 法

采 用 12 h 昼/12 h 夜饲养周期，一雌二雄同笼过夜，次晨雌鼠阴道分泌物涂片检查有阴栓出现确定为妊娠雌鼠，孕 周 为 O 天。孕 15、 18、 2 0 天 雌 性 S D 大鼠行剖宫产术取胎鼠。

2 ) 胎肝细胞分离

⑴手 术 方 法 : 怀 孕 雌 性 S D 大 鼠 术 前 12 h 禁 食 ， 4 h 禁水。动物称重后按照 30 mg/kg肌肉注射 0.3% 戊巴比妥钠溶液，麻醉后仰卧固定于动物手术台，8 % 硫化钠腹部脱毛备皮，乙醇、碘伏消毒后铺无菌孔巾。取下腹正中切口，长 约 4c m ，进腹。可见怀孕大鼠为双子 宫 ，肌层透明，胎鼠清晰可见，依次排列， 7——12 只数目不等。分离子宫各韧带后将双子宫完整切除，置于含 4°C H a n k 缓冲液无菌培养皿中，母鼠依次缝合关腹。

(2) 分离方法：将盛有子宫的无菌培养皿转移至超净工作台冰浴盒上操作，剪开子宫肌层及胎膜，去除胎盘脐带， Hank 缓冲液洗净羊水及血液。剪开胎鼠腹壁，完整取出胎肝、，去除胆囊后用 Hank 缓冲液洗净血液，手术刀切割成 ImmxImmxImm 大小的组织块 ，置 于 15m l 无菌离心管中。

⑶ 无 菌 离 心 管 加 入 0.05% 胶原酶缓冲液，比例为 O.lg/m l ，将无菌离心管置于37℃温水浴振荡箱中振荡 15 min，频 率 5 0 次/min。无 菌 lOOium 尼龙滤网过滤 2 次 ，未消化组织块在无菌细胞培养皿中用无菌玻璃试管底机械法研磨为组织勻浆，加 入 H a n k 缓冲液过 滤 ，过滤后胎肝组织悬液低温离心机离心 2 min，转 速 l2 〇 Or/min。细胞沉淀用 H a n k 缓冲液重悬，重复上述操作一次。最 后 加 入 H a n k 缓冲液制成单细胞悬液。台盼蓝活性检测 ，细胞计数。

3 ) 胎肝细胞纯化
(1) 将分离的胎肝细胞悬液按体积比 1 : 1 0 的比例加入红细胞裂解液，置于无菌离心管中，低温机离心3 min、，转 速 1200r/min。

⑵ 离 心 后 小 心 去 除 上 清 ，用 含 0 X 4 3 抗体(15ug/ml)、 0 X 4 4 抗体(18ug/ml) 的完全培 养 基 D M E M 2m l 加入到无菌离心管，将细胞沉淀重悬，吸附造血干细胞， 静置IOmin0

(3) 同时将羊抗小鼠 I g G 血 清 稀 释 10 倍 ，取 IOml 平 铺 于 90 mm 无菌培养皿 B 中，使之完全覆盖培养皿底，室温孵育 40 min。

(4) 磷酸盐缓冲液漂洗无菌培养皿 3 次 , 用 含 1 % 胎牛血清的 H a n k 缓 冲 液漂洗 1 次。

(5) 将无菌离心管 A (含胎肝细胞)中的纯化培养基小心加入含羊抗小鼠IgG 血清无菌培 养 皿 B 中， 4 ¾ 静 置 lOmin。 将造血干细胞免疫吸附沉淀到无菌培养皿 B 底部。

(6) 无菌巴斯德吸管小心吸取无菌培养皿 B 中的上清，内含未被吸附的细胞，用磷酸盐缓冲液小心漂洗培养皿 3 次 ，收集上清及漂洗液，低温离心 2 min，转 速 1200r/min。获得的细胞沉淀即为纯化后的胎肝细胞。

(7) 2m l H a n k 缓冲液重悬细胞沉淀，细胞计数，台盼蓝活性鉴定。

纯 化 胎 肝 干 细 胞 培 养

1 ) 条件培养基的配制
胰 高 血 糖 素 100ng/ml，胰 岛 素 lOug/ml，转 铁 蛋 白 10ug/m l，氢化可的松 60mg/ml，甲 状 腺 素 50mnol/L ， 表 皮 生 长 因 子 25ng/m l， 硒 酸 钠 5ng/m l， 甲状腺素，尼克酞胺
10 mmol/L ，亚 油 酸 50ng/ml, 醋酸维生素 E 1 ug/mi， 维 生 素 C O.lmmol/L ， 其他成分同普通培养基。

2 ) 条件培养液体外诱导胎肝干细胞定向分化
将分离富集的胎肝细胞浓度稀释为IxlO⁶个/ml， 取 0.5m l 接 种 于 2 4 孔培养板 (2 cm2/孔)， 接种密度为2.5xl〇5 个/c m 2, 加 入 l .5m l 条件培养基。培养 条 件 3 7℃ 、 5 % C0 2。 培
养 18〜 20 h 后 H a n k 缓冲液冲洗后去除未附壁的胎肝细胞，更换培养基。以后每 24 h 更换一次培养基。

骨 髓 来 源 肝 脏 干 细 胞 的 分 离 培 养 扩 増 与 定 向 诱 导 分 化

骨髓来源的干细胞具有多向分化潜能。特别是具有向肝脏干细胞、肝脏细胞及血管内皮细胞分化的潜能 (FerrarietaL 2000)，加之其具有来源丰富，取材方便，操作技术相对成熟，源于自体，无免疫排斥问题等优势，因而有望成为肝脏组织工程或肝脏再生细胞治疗中新的种子细胞来源。自 1999 年首次发现大鼠的骨髓细胞可以分化为肝脏卵圆细胞 ，并进而分化为肝脏细胞和胆管上皮细胞以来，不断有研究结果支持这一观点。然而也有一些研究提出了骨髓源性干细胞在肝内与肝脏细胞融合的证据，认为肝内出现的新
标志细胞是植入细胞与受体肝脏细胞的融合而不是由干细胞转分化而来。有报道在对初始细胞状态、分化环境等严格控制的条件下，证明骨髓干细胞可以转分化为肝脏细胞而没有发生细胞融合，当骨髓干细胞与损伤的肝组织 (或细胞)在分隔的体系中共培养时，损伤肝脏组织 (或细胞) 分泌的因子刺激了干细胞向肝脏细胞分化的潜能，但由于骨髓干细胞不与肝脏组织直接接触因此排除了细胞融合的可能性，并且骨髓干细胞在移植人肝脏损伤大鼠体内后，随着肝组织损伤程度的增加，干细胞转化为有活性的肝脏细胞，肝
脏功能在细胞移植后 2——7天将得以恢复 (Jang et al.2004)。

迄今为止，人们把骨髓中存在的干细胞分为 3 类 (尽管 3 类细胞之间在界定上有不同程度的不确定及交叉): 造血干细胞(hematopoietic stem cell,H S C )，间充质干细胞(mesenchymalstem cell, M S C )和多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cell, M A P C )。骨髓内含有如此多种细胞类型，具体是哪种细胞群体能分化为肝脏细胞，目前各家报道尚不一致，这将涉及多个细胞表面标记，既有造血系细胞，又有间质系细胞，因此寻找可以纯化的骨髓源性肝脏干细胞的确切的表面标记显得尤为重要。P2 微球蛋白(P2M )是哺乳动物体内广泛表达于有核细胞表面、最具保守性的蛋白质，由于其不出现于某些永生性生长的肿瘤细胞及囊胚期 E S 细胞表面，因此 p2] VT细胞被认为是具有旺盛增殖潜能的细胞；此外，
骨髓中造血干细胞表面标志 Thy-I+细胞具有向成熟肝脏细胞分化的潜能。故推测，骨髓来源的 Thy-I+P2JVT 细胞(bone marrow derived Thy-I+P2N T cell,B D T C 河能是骨髓中的肝脏干/祖细胞(Avital et al.2001)。

本实验采用两步间接免疫磁珠分选的方法得到骨髓中表面标志 Thy-I+P2AT 的细胞，并通过添加因子直接培养的方法以及 Tm nsw dl 体系共培养的方法诱导骨髓来源肝脏干细胞进行体夕卜定向诱导分化

1 ) 实验所需仪器及材料
①近 f 系 Fisher344 大鼠；②大剪刀以及小剪刀 (各 2 把)，镊子 ( 2 把)，无菌托盘；③全自动高速冷冻离心机；④超净工作台；⑤普通光学显微镜；⑥胎牛血清， DM EM 培养 基 ； ⑦ M ACS磁性分离仪、分离柱；⑧ M ACS磁性细胞分离试剂盒(抗CD34抗体、磁珠)； ⑨ P B S 缓冲液；⑩ 200 呵 钢筛网； ⑪ IOm l 离心管，吸管， IOOmm 组织培养皿 ，纱 布 ；⑫ 一 次 性 5 ml、IOml 注射器；@ 羊抗 兔 I g G 标记的免疫磁珠；⑭ 兔 抗 大 鼠 Thy-1、P2M 多克隆抗体； ⑫ 淋巴细胞分离液 (Ficoll， p = 1.083 g/ml)。

2 ) 大鼠骨髓来源的 Thy-l⁺p2M^-细胞分离方法

(1) 准备近交系 Fisher34 4 大鼠，体 重 150——180 g ，饲养于清洁级、 2 2℃恒温鼠房， 12 h交替照明，自由进食和饮水，实 验前 2 天单独喂养；

(2) 将 F344 大鼠断颈处死 ， 70% 乙醇浸泡 IOmin 清洗消毒后置于无菌托盘内；

(3) 无菌条件下剥皮，分别从大鼠的肩关节和髋关节处解剖四肢，切除爪，取出四肢骨放入盛有 P B S 的 IOOmm 组织培养皿中，反复冲洗四肢骨表面残留血细胞，将冲洗干净的四肢骨移入另一含10% 胎牛血清的DM EM 培 养 液 的 IOOmm 组织培养皿中，使用剪刀镊子断离两侧骨骺，通 过 5m l 注射器用完全培养液反复冲洗骨髓腔以及富含骨髓细胞的骨飯，尽量将骨髓细胞完全冲出；

⑷ 将 冲 出 的 骨 髓 细 胞 经 2〇〇目筛网过滤后，重悬于培养液中形成细胞悬液，然后在 无 菌 IOmI离心管中加入 5m l 淋巴细胞分离液，再缓慢沿管壁加入5m l 细胞悬液，2〇°C 、1500r/m i n 离 心 20 min，分离出单个核细胞；

(5) 收集中间的单个核细胞层，用 DM EM 培养液离心 (1500r/min、 5 min) 洗 涤 2 次 ；

(6) 加入 兔 抗 大 鼠 抗 体 10 W 轻轻混勻后，4℃ 孵育30min,1500r/min离 心 5 min,P B S 洗 2 次;

(7) 加入磁珠标记的羊抗兔 1 gG ， 孵 育 30 min, 1500r/min离 心 5 min， P B S 洗 2 遍;

(8) 将分离柱固定于M A C S 磁场内，用除 气 的 M A C S 缓冲液 (真空抽气)2m l 冲洗分离 柱 ；

(9) 将单细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，避免产生气泡，以 2m l除气的M ACS 缓冲液洗涤，收集洗脱组分， 2000r/min离心，弃上清，得到 p2M_细胞；

(10) 将收集到的 P2NT细胞再先后与兔抗大鼠 Thy-I 抗体和磁珠标记的羊抗兔 IgG 4℃ 孵育；

(11) 细胞洗涤后经 MACS 高梯度磁场分选， Thy-I⁺细 胞 被 MACS缓冲液冲出；将磁 性 分 离 柱 移 离 磁 场 ，用缓冲液洗脱滞留于分离柱内的细胞，得到大鼠骨髓来源的Thy-l⁺p W 细胞(BDTC)，台盼蓝染色检测细胞存活率大于 9 5 % ，细 胞 置 代 备 用 。
注意：以上操作均严格按照无菌操作规程。

骨 髓 来 源 肝 脏 干 细 胞 ( B D H S C) 的 培 养 扩 增 与 定 向 诱 导 分 化

骨髓来源肝脏干细胞的增殖分化主要受到细胞因子和(或) 生长因子的调控。研究表明 ， 抑瘤素(oncostatin M ， OSM)、 表皮生长因子 (EGF)、 FGF、 肝脏细胞生长因子(HGF)等在肝脏损伤后修复和再生的不同时期均发挥一定的作用 (JauregUi et al. 1999)。采用特定肝脏细胞培养液，以 HGF 和 EGF 诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝脏细胞样细胞定向分化。
4.6.2.2.1 直接法诱导骨髓 Thy-1+ P2IVT(bone marrow derived Thy-I + P2M-cell,BDTC)的细胞向肝脏细胞分化

1 ) 实验所需仪器及材料

①胎牛血清，尚 糖 D M E M 培养基；②全自动高速离心机；③ IOml离心管，吸管；④ Hepes; ⑤地塞米松；⑥表皮生长因子(E G F )，肝脏细胞生长因子(H G F );⑦ 6 孔培养板;⑧超净工作台；⑨胰蛋白酶；⑩ Matrigel。

2 ) 骨髓来源肝脏干细胞的诱导分化
将收集的大鼠 BDTClxlO4个/孔的密度接种于铺有 2 mg/L Matrigel的 6 孔培养板中，条件培养液为尚糖 DMEM， 其 中 含 10% 胎牛血清、 20 mmol/LHepes、 10_7mol/L 地塞米松 、 20|ig/LHGF、 2(^g/LEGF 及 部 分 微 量元素和青链霉素，隔 日 半 量 换 液 1 次 。

4-6.2.2.2 Transwell 体系共培养诱导骨髓 Thy-I +P2IVT细胞向肝脏细胞分化

有证据显示肝脏损伤后释放的大量促进肝再生的可溶性细胞因子及生长因子等构成/ 适宜的微环境 (Gonzalez-Reyes et al. 2003), 所以我们通过利用 Transwell 体系共培养BDTC 和丙烯醇 (allyl alcohol, A A ) 损伤的肝脏细胞，并且添加适当细胞因子和生长因子，在体外通过细胞工程的方法，创造适于干细胞增殖和向肝脏细胞分化成熟的环境，以骨髓干细胞作为种子细胞，大量生产有功能的肝脏细胞。

1 ) 灌注法 A A 损伤肝脏细胞悬液的制备的材料

① 9——10 周龄、体 重 150〜 170 g 的 Wistar 大鼠； ②输出速度为 4〜60 ml/min的蠕动泵；
③ 桂胶管 (0.078 IDx0.125OD) ; ④外科手术器械 (大、小组织剪、镊子、止血钳、 18 号套管针、 4 号手术丝线、棉球、纱布等)； ⑤ 7 5 % 乙醇； ⑥戊巴比妥钠(sodium pentobarbital);⑦ 8 0 目微孔滤膜；⑧细胞培养基(RPMI1640、 10% F C S 、 10^-7mol/L 地塞米松10ug/ml胰岛素、 5ng/ml 转铁蛋白)。

2 ) 灌注法 A A 损伤肝脏细胞悬液的制备

(1) 提 前 24 h 经腹膜内注射 A A 0.62 mmol/kg， 建立急性肝衰竭模型。

(2) 用 500m l 无菌水灌注管道，调整螺动泵的流速为 16 ml/min。

(3) 腹膜下注射 0.2 ml/200 g 戊巴比妥钠麻醉大鼠，固定并消毒大鼠，以 E G T A 溶液灌注管道。

(4) 在一对止血钳的配合下，沿正中线从耻骨到胸骨打开腹腔，沿切口的中线做水平切口，充分暴露腹腔；以蘸 E G T A 的棉球将肠管推开，暴露肝脏；轻轻上翻肝叶，暴露门静脉和下腔静脉；在右肾静脉分支上方用丝线将腔静脉打一活结；分别在离肝脏较近和较远处的门静脉下方置两根丝线；在眼科镊子的协助下进行门静脉穿刺，穿刺点位于距进入肝叶的静脉分支约 1.5c m 处。操作过程注意保持套管针与门静脉的平行以免刺破血管后壁，拔除套管针后立即打双结，将管道连接至套管，开始灌注。

(5) 在肾脏下方切断腔静脉，肝脏立即变白；入胸腔切断腔静脉。扎紧肾脏上方的腔静脉，用纱布吸净胸腔内的积血/液。

(6) 继 续 灌 注 EGTA 液 体 4 min，停 泵 ；换 IxLeffert 缓冲液，灌 注 2 min，停 栗 ；加入消化液灌注，直至肝脏裂开，停 泵 ；除去胸腔内的积液。

(7) 用消过毒的止血钳和剪刀切下消化理想的肝叶部分放人培养皿中；向消化的肝叶加入冰冷的CaCl2 溶液，用 2 把解剖刀分离肝叶。

(8) 在橡皮细胞刮子的协助下，用 8 0 目滤网及漏斗过滤细胞至 150 ml H B S S 平皿内，将细胞转移至 50m l 离心管中， 50 g 离 心 1〜 4 min; 用清洗缓冲液重悬细胞，洗 3 次 ；以10——20 ml CaCl2 溶液重悬细胞。

(9) 向 80ul H B S S 中加入 IOul细胞和 IOul 〇• 4 % 台盼蓝，在显微镜下观察细胞活力。

B D T C 诱导体系的建立

1 ) 材料与方法

(1) D M E M /F 12 完全培养液。

(2) 条 件 培 养 液 ：向 完 全 培 养 液 中 加 入 lxITS、尼 克 酰 胺 0.61 g/L、地塞米松0.lunmoL/L 、牛血清白蛋白(B S A )2 g/L 、葡萄糖 lg/L 、半乳糖 2 g/L 、鸟氨酸 0.1 g/L 、脯氨酸 0.03 g/L 、谷氨酰胺0.73 g/L 及适量微量元素(氯化梓、硫酸锌和氯化猛)等 。

⑶ 细 胞 因 子 和 生 长 因 子 ： h H G F 和 b F G F 。

⑷ Tmnswell 培养板。

(5) Matrigel。

2) 细胞培养的放置

将从灌注法中获取的 A A 损伤的肝脏细胞按 3x IO⁴个/c m2 接种于铺有 I 型鼠尾胶原的 Tmnswell 培养板上室，将 BDTC 按 5x l〇⁴个/c m 2 接种于铺有 Matrigel的下室 (图4.26)。
态的变化。

检测方法

1) 普通光镜观察
在 B D T C 与 A A 损伤肝脏细胞共培养体系的下室中，接种的部分 B D T C 于诱导第 7天体积明显增大，核浆比例大，出现大而圆的单个、双个甚至多个细胞核，细胞质丰富，部分细胞处于分裂相；相反 ， B D T C 与正常肝脏细胞共培养组及单独培养时均未见其^态发生变化 (图4.27)。

2 ) 透射电镜形态观察肝脏细胞超微结构
B D T C 诱 导 至 7 天时，取出共培养体系中的上室，以 3 % 戊二醛于培养皿原位 4℃ 前固 定 2 h ，以 1 % 锇 酸 4 1 后 固 定 Ih后 ，蔗糖缓冲液反复漂洗，梯度乙醇脱水、入丙酮后，以树脂渗透、包埋、聚合，用 U L T R A C U T E /S 型切片机超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅双
重染色， Philips C M 120 透射电子显微镜观察细胞超微结构。

3 ) 免疫细胞化学检测
将 诱 导 7 天的细胞用胰酶消化 后 50 g 离心、诱导前的细胞 500 g
离心后分别制成细胞悬液，细胞甩片 ，多聚甲醛固定和羊血清封闭后 ，分 别 与 抗 Thy-I 、 白蛋白(albumin， Alb)和 甲 胎 蛋 白 (AFP)抗体孵育，以 S P 试剂盒进行免疫细胞化学检测， D A B 试剂盒显色。

4 ) 细胞培养上清中尿素和白
蛋白的产量诱导分化 7 天 的 BDTC 经 PBS冲洗换用无血清的D M E M 培养基，加 入 〇.15mol/L 的 N H 4Cl, 常规培养 8 h 后收集细胞
培养的上清，在全自动生化分析仪上检测培养上清中尿素和白蛋白的分泌量。

5) ICG(indocyaninegreen， 靛青绿)摄取、排泌实验将诱导分化7 天 的 B D T C 用 P B S 冲洗后，加 入 lmg/nj I C G 于 37T ：孵 育 15 min 后 ，显微镜下观察细胞颜色的变化。再 用 P B S 冲 洗 2 遍 ，换回完全培养液继续常规培养，并
观察细胞颜色的变化(图4.28)。

6) RT-PCR 方法检测
还 可 以 用 R T - P C R 的 方 法 检 测 B D T C 诱导前、后肝脏细胞相关基因 (A F P 、 Alb 、C T P 257、 C X /S 、 CXZ9 、 HNF和 ; 等 ) m R N A 的表达变化等