方案6 羧基端序列分析实验

一、将蛋白质转移到 PVDF 膜上

步骤1 利用电印迹法或从溶液中直接吸收（利用 ProSorb 样品制备容器），向 PVDF 膜转移 50?IOOpmol 的蛋白质样品。具体如下。

对于蛋白质电印迹到 PVDF 膜：

1.将凝胶中分离的蛋白质电转移到一张 PVDF 膜上（见方案 2 和 Mozdzanowski,et al,1992)。

2.用考马斯亮蓝 R250(见方案 3) 浸染含有目的蛋白的 PVDF 膜。将膜在空气中晾干。

实验提示：可以用两张纸夹住膜，挂在化学容器中或直接在工作台上干燥，不过要在膜上盖一张滤纸以防止污染。

3.切下目的蛋白条带或点

如果不是立即进行分析，条带/点可以在 -20°C 下保存几个月。

4.如果需要同时进行氨基端序列分析和羧基端序列分析，那么进行步骤2，对固定在 PVDF 膜上的样品进行氨基端测序；如果只需做羧基端测序，那么将结合在膜上的蛋白点放入 1.5 ml 微量离心管，进行步骤3。

对于将溶液中的蛋白吸附到 PVDF 膜（ProSorb):

1.用 5ul 的甲醇润湿 PVDF 膜。

2.向样品贮存器中加入 100ul 0.5% 的 TFA。

3.向样品贮存器中加入 5~800ul 蛋白质样品缓冲液。

4.如果样品缓冲液中含有盐分或其他低分子量杂质，用 100ul 0.1% 的 TFA 洗膜，洗 2 遍以上。

5.将内有 PVDF 膜的样品贮存器嵌入到一个培养皿中，确保结合蛋白质的膜面朝上。

6.用一个玻璃烧杯罩住嵌入的膜（在贮存器中），将培养皿置于设为 60°C 的加热块上。完全干燥 PVDF 膜（约 20 min)。

目的是在 PVFD 膜干燥的过程中避免接触空气中的污染物，也避免烧杯接触到膜。

7.小心地取出 PVDF 膜。

8.如果需要同时进行氨基端序列分析和羧基端序列分析，那么进行步骤②，对固定在 PVDF 膜上的样品进行氨基端测序；如果只需做羧基端测序，那么将结合在膜上的蛋白点放入 1.5 ml 微量离心管，进行步骤③。

二、氨基酸测序

步骤2 依次进行氨基端和羧基端测序：

1.以 5~25 个循环进行氨基端序列分析。

2.将膜放入 1.5 ml 微量离心管，进行步骤③。

步骤3 准备羧基端测序的样品:

1.向 PVDF 胰加人『1: 溶于庚 5%DIEA, 使庚練在 6(TC 蒸发约 Imin0

2.加人 5ul 溶于乙腈的 1% PIC，60℃ 温育 5 min。

3.将带有 PIC-衍生样品的 PVDF 膜转移到羧基端测序仪器中的反应器内。