骨 骼 肌 源 干 细 胞 的 分 离 培 养

骨 骼 肌 源 干 细 胞 的 分 离 培 养

这里仅介绍经典的预种植技术(preplate technique)，该方法主要利用肌肉源干细胞和成纤维细胞、内皮细胞等的黏附性的差异来将M D S C 分离，下面以大鼠为例予以介绍。

(1) 实验动物： 3——8周 龄 SD 大鼠。

(2) 无菌条件下切取大鼠后肢腓肠肌，用眼科剪剪碎。

(3) 在 37T 条件下，依次用以下3 种酶消化： 0.2% 胶 原 酶 X I 消 化 lh， 0.3% dCTP酶 消 化 45 min ， 0.1% 胰酶消化30 min。

(4) 消化后的细胞悬液置于I 型胶原酶包被的培养皿中，培养基为含1〇% 胎 牛 血 清 ，1 0 % 马血清 ， 0 . 5 % 鸡胚提取物及1 % 青链霉素的DMEM培养基。

(5) Ih 后 ，将未黏附的悬浮细胞转移到第2 瓶中，第 1 瓶中再加入新鲜培养基，即为 ppUpreplatel) ; 第 2 瓶在培养2处 后 ，悬浮细胞转至第3 瓶 ；第 3 瓶在培养24 h )^，悬浮细胞转至第4 瓶 ；直 至 第 6 瓶 ，时间间隔均为24 h 。即可获得从p p 1 到 pp6 逐步纯化 的 MDSC其 中 PP1——PP4称作前期种植细胞，PP5——PP6称作后期种植细胞(lateplate, LP)。

(6) M D S C 的免疫组织化学鉴定：具体方法参考4.3.2。
MDSC—般为 CD34⁺、 Sca-1⁺、 desmin⁺、 C d45^- 。

4 . 5 . 4 骨 骼 肌 源 干 细 胞 的 分 化

骨傲肌源干细胞具有多向分化潜能，除能向骨豁肌、心肌和平滑肌分化外还能向神经 、成骨和造血系分化，下面分别给予介绍。

骨 骼 肌 分 化

(1)肌源性干细胞的分离参照前述的预种植方法

(2) M D S C 按 IxlO⁵ 个/m l 的密度种植于铺有1 % 的 I 型胶原酶的培养皿中。增殖培养基：低糖 D M E M 、 20% F C S 、 15% HS(human serum, 人血清)、 6ng/ml 重组人碱性成纤维生长因子rh b F G F 、 100U /m l 青霉素、 100ug/m l 链霉素。

(3) 37℃ 、 5 % C 0 2培养箱培养，每 24 h 加入 6ng/mlrh b F G F 。

(4) 每 3 天换液一次。

(5) 7〜 10天 按 1 传 2 传代。

(6) 在5——10代时进行诱导分化。
诱导培养基：低 糖 D M E M 、 7.5%H S 、 6ug/m l 胰岛素。

(7) 7 天后即可见相互融合的肌管形成和表达横纹肌肌动蛋白和desmin+的骨骼肌纤维。

平 滑 肌 分 化

这里介绍一种共培养的方法诱导大鼠M D S C 向平滑肌的分化。

(1) 大 鼠 M D S C 采用预种植技术分离3——8周龄的S D 大鼠的后肢。

(2) 平滑肌细胞取自提供M D S C 大鼠的膀胱，无菌切取大鼠膀胱，用眼科慑和眼科剪逐步分离除去膀胱内外侧的黏膜层和浆膜层，用剃须刀片将平滑肌层切碎， 37℃ 条件下 ，用 0.25% 的胰酶(含 0.02% E D T A )消 化 lh，1 0 0 目筛网过滤除去组织块，细施悬液200 g离 心 5 min，弃上清液。

(3) 将大鼠膀胱平滑肌细胞和M D S C 共培养于I 型胶原酶包被的培养皿中。
培养基：低 糖 D M E M 、 10% F C S 、 10% H S 、 0.5% 鸡胚提取物、 lOOUg/m l 青霉素、100ug/ml 链霉素。

(4) 平滑肌细胞的鉴定通过免疫组织化学检测&平滑肌肌动蛋白(a-S M A )。

成 骨 分 化

(1) M D S C 分离同前，采用预种植方法。

(2) 培养条件：采用增殖培养基。
增殖培养基：低 糖 D M E M 、 10% F C S 、 10% H S 、 0.5% 鸡胚提取物、 100U /m l 青霉素、100ug/ml 链霉素。

(3)诱 导 剂 为 200ng/m l 的人重组骨形成蛋白-2(r hBMP-2)，每 3 天换液一次， 37℃，5 % C O 2培养箱中培养。

(4) 培养1周后即可见具有成骨细胞系标记骨钙素 (osteocalcin)阳性的细胞增多。同时 ，可通过反复冻融使细胞裂解，检测碱性磷酸酶(A L P )活性来判定成骨转化。

神 经 细 胞 分 化

(1) M D S C 分离同前，采用预种植方法。

(2) 培养条件：采用诱导培养基。

诱导培养基： D M E M /F 12、 20|ig/L rhEGF、 l〇iug/L b F G F 、 2 mmol/L L -谷氨酰胺、
33 mmol/L 葡萄糖、 9.26 g/ml 腐胺、 6.3ng/L 孕酮、 5.3ng/L 亚硒盐、 0.0025 g/L 胰岛素、
O.lg/L 转铁蛋白、 100U /m l 青霉素、 10〇 ug /m l 链霉素。

⑶ 培 养 约 1 0 天后，即可见到表达相应神经标记物的神经元样和神经胶质样细胞。

造 血 系 分 化

(I) M D S C 分离同前，采用预种植方法。

⑵ 将 IxlO⁶个 M D S C 种 于 I O c m 的组织培养皿中， 37℃、 5 % C O 2培养箱培养。
诱导培养基:M E M 、 10% H S 、 100U /m l 青霉素、 lOOug/m l 链 霉 素 ，每 2 天 加 入 5ng/ml干细胞生长因子 (SCF) 和白细胞介素-6(IL-6)，或 5ng/ml S C F 、 Flt-3L 和巨核细胞生长发育因子 (M G D F )。

(3) 培 养 10天后即可见带有造血系细胞标记的分化细胞，如 造 血 干 细 胞 标 记 C-kit阳性细胞出现，可用流式细胞仪检测。
至于骨髓源干细胞向心肌细胞的分化，目前尚存在一定争议，这里不作详细介绍。相信除以上介绍的分化途径以外，还有其他很多方法可用于M D S C 的分离和诱导分化，因此需要依据实验目的和实验对象的不同加以选择。由 于 M D S C 是一种异质细胞群，目前其详细的组成还不清楚，具体实验时还要进行条件的优化和摸索，以上方案仅供参考