方案5 磷酸化多肽的固相微量测序实验

1.将放射性标记的肽段在小试管中溶解于 20ul 适当的溶剂中（如含或不含 0.1%TFA 的 30% 乙腈水溶液，可能会将多肽从 RP-HPLC 柱上洗脱下来）。加热混合物至 55°C，直至溶解。

2.用契仑科夫法在闪烁计数器中计数（注音：契仑科夫计数时不加闪烁液）。

3.将 Sequelon-AA 盘从试剂盒中取出，放置于 55°C 的聚醋薄膜上。

4.滴加放射性标记的多肽到 Sequelon-AA 盘上，将盘完全干透。在闪烁计数器中对盘和样品管进行计数。注意：仍然不加任何闪烁液。

5.清洗管 3 次，每次用 10~20ul 多肽溶剂（与溶解多肽的溶液相同）。将清洗液滴加到 Sequelon-AA 盘上，每一次滴加后待晾干才能接着再滴加。如果样品管仍有计数信号，继续清洗。

6.不加任何闪烁液，在闪烁计数器中检测盘子。

7.向测试管中滴加 100ul 偶联缓冲液，加入 1mg 水溶性的碳二亚胺试剂 EDC。

8.向空盘上滴加 5ul EDC 溶液，使反应在室温下进行 20 min。

9.样品偶联后，像步骤⑤那样用多肽溶剂清洗几次，将没有进行共价结合的多肽洗去—因为它们在测序时会产生背景。在闪烁计数器中对盘子进行计数。

10.用含 2 mmol/L 磷酸钠的甲醇-水（9:1) 溶液代替 S3 试剂（氯丁烷）。

11.将盘子放进蛋白质测序仪的反应容器中，使用含 2 mmol/L 磷酸钠的甲醇-水 (9:1) 溶液。用 ATZ 收集程序进行标准的 Edman 测序。

这样将直接把最后的 ATZ 产物和 32P 标记的磷酸送入分段收集器。可以改进该程序，以便达到最佳的递送试剂和溶剂的时间。含水的甲醇比氯丁烷具有更髙的黏性，所以传送时间需要更长。更「精确」的仪器型号还会有确保递送正确进行的传感器，但不论怎样，一定要确保完善的试剂递送效果。

12.在计数器中对溶于闪烁液的部分收集器中的样品进行计数。

在这里最好使用闪烁液。它大约可使放射性活性增大一倍，尽管背景也会相应地增高，但目前还没有很好的方法提高信噪比。

13.检查 Edman 降解的效率，从测序仪反应器中取出盘子，晾干，再在闪烁计数器上检查残留的放射性水平。

通常会剩下 10%~20% 的初始量，这主要取决于残基数和测序仪的长度，可归因于每一降解循环中正常的循环收率和累积的阻断情况。