血管内皮祖细胞

血管内皮祖细胞

大量研究表明，胎 肝 、脐带血、骨髓和外周血中均含有血管内皮祖细胞(endothelialprogenitor cell, EPC)，这些内皮祖细胞主要表达CD34、 VEGFR-2、 CD133等表面标志，故利用这些标志可不同程度地富集EPC。 但由•于血管内皮祖细胞与成熟的内皮细胞都具有一些相同的表面标志，包 括 CD34、 VEGFR-2、 Tie-I 、 Tie-2和 VE-钙黏着蛋白(vascularendothelial cadherin) 等 ，所以通过上述标志筛选的细胞中可能混有成熟的内皮细胞。近年来 报 道 CD1 3 3 是 一 种 5 次跨膜的细胞表面分子，分子质量为i 2 〇 kDa，它选择性地表达于骨髓和外周血造血干细胞及内皮祖细胞表面 (Yinet al.1997)。 因此，采 用 CD133分选可排除血管壁脱落的成熟内皮细胞(Quirici et al.2001)。

材 料 和 试 剂

① M A C S 磁性分离仪、分离柱;② M A C S 磁性细胞分离试剂盒 (C D 133⁺细胞、U E A -I^{+</sup细胞)；③脐带血、夕卜周血或骨髓；④ P B S 缓冲液；⑤淋巴细胞分离液；⑥ E D T A ; ⑦胰
蛋白酶；⑧纤连蛋白；⑨ I M D M 、 M 199培养基；⑩ F B S ; ⑪ V E G F ; ⑫ b F G F ; ⑬ IGF-1;⑭ F I T C 标记的抗荆豆凝集素抗体； ⑫ 抗 人 C D 133、 C D M 、 v W F 、 Tie-2、 K D R 、 C D 105、
V C A M -1(C D 106)、 V E -钙黏着蛋白(C D 144)、 P E C A M -1(C D 31)、 UEA-I 等抗体； ⑭ DiI标 记 的 Ac-L D L ; ⑫ 离 心 管 、吸管、培养板等。}

CD133+血 管 内 皮 祖 细 胞 的 分 离

( 1 ) 收集正常人外周血，加入不含防腐剂的肝素 (终浓度为 20U /m l); 或收集经过抗凝处理的脐带血；或无菌条件下，抽取正常人骨髓。

( 2 ) 用 2〜 4 倍 体 积 的 PBS溶液 (添加2 mm 〇 l/L EDTA)稀释外周血或骨髓细胞悬液；用 4 倍体积的 PBS溶液 (添加2 mmol/ L EDTA)稀释脐带血。

(3) 将 35m l 稀释的细胞悬液轻轻叠加到15 mlFiC〇ll-P a q u e 细胞分离液上。

(4) 20℃ 、 400 g 离心 35 min。

(5)收集界面层的单个核细胞，用 PBS洗涤细胞2 次 ， 2 0℃ 、 200 g离 心 lOmin。

(6) 将细胞重悬于 300ulP B S 中 (所含细胞量≤l O ⁸个)，加 人 100ul \F c R 阻断剂，混匀。然 后 加 入 IOOul磁珠稱联的CD133单克隆抗体，细胞悬液总体积为500ul，充分混匀，6——12°C孵育 30 min。

(7) 用 5〜 IOml PBS洗涤细胞2 次 ，以去除未结合的抗体。用500ul PBS(添加2 mmol/LEDTA)缓冲液重悬细胞以备用。

(8) 将分离柱至于磁场中，以 2m l 分离缓冲液冲洗分离柱。

(9) 将 标 记 CD133单抗的细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，避免产生气泡，细胞悬液从分离柱下端自然流出。

(10) 用 5 0 0 ul 分离缓冲液洗涤分离柱，洗掉不能结合到柱上的细胞，共 4 次 。

(11) 将分离柱移 出 磁 场 ，加 I m l 分离缓冲液加压洗脱吸附细胞，即 为 C D 133⁺细 胞 。

内 皮 祖 细 胞 的 培 养 及 分 化

⑴ 纤 连 蛋 白 用 P B S 溶 解 稀 释 为 lng/ 4 后 包 被 2 4 孔 板 ，每 孔 中 加 入 100ul，置于3 7℃ 温箱中孵育2 h ，临用前吸出多余的液体，用 P B S 洗 涤 2 次 。

⑵ 将 富 集 的 C D 133⁺细胞(lxl〇⁵——2xl0⁵个/c m 2)接种于纤连蛋白包被孔板中，添加内皮细胞培养液。
内皮细胞培养液： M 199 培养基、 10% F B S 、 V E G F 50ng/ml、 bFGF lng/ml、 IGF-I2ng/ml〇

⑶ 将 细 胞 置 于 3 7 ℃ 、 5 % C O 2及饱和湿度的培养箱中培养3——4周，每 3——4天 更 换 培养液。

(4) 内皮细胞的纯化及扩增：

a. 0.25 % 胰酶消化细胞后，用 含 10% F B S 的 I M D M 培养液洗涤细胞2 次 ，收集所有细胞(2xl〇⁶——4xl〇⁶个)重悬于1〇〇 ul上述培养液中，并 与 FIT C 标记的抗荆豆
凝集素 (ulex europaeus agglutinin-1， U E A -1)抗体于 4 ℃ 孵育 15 min

b.洗涤细胞2 次 ，重悬细胞，添加 抗 F I T C 的磁珠， 孵 育 15 min。

c. 洗涤细胞，上柱分选出U E A -I⁺ 细胞(具体步骤参考C D 133⁺细胞的分选)。

d.将富集的U E A -I+细胞(IxlO⁵〜 2xl〇⁵ 个/c m ²)接种于纤连蛋白包被孔板中，添加内皮细胞培养液。

e. 将细胞置于37℃ 、 5 % C O 2及饱和湿度的培养箱中继续培养3——4周，每 3〜 4 天更换一次培养液。

(5) 内皮细胞的鉴定：
a.细 胞 表 面 标 志 的 检 测 ：0.25% 胰酶(含1111111〇 1/1^0丁八）消化培养扩增的内皮细胞 ，将 2.5xl〇⁵磁珠分选的C D 133⁺细胞或分选后扩增的细胞重悬于5 0 ul含 20%
F B S 的 R P M I -164〇培养液中，分别加入小鼠抗人vWF(von willebrand factor)、Tie-2、 K D R 、 C D 105、 V C A M -1(C D 106)、 V E -钙黏着蛋白(C D 144)等抗体，阴性对照管不加一抗， 4°C 孵 育 30 min， P B S 洗 涤 细 胞 3 次 ，加 入 F I T C 标记的
兔 抗 鼠 IgG, 4 ^ 孵 育 30 min; 或直接加入P E 标 记 的抗人C D 133、 C D 3 4 抗 体 ，F I T C 标 记 的 抗 人 P E C A M -1(C D 31)、 U E A -I 等抗体，阴性对照管加人P E 或F I T C 标记的同 型 鼠 IgG，室 温 孵 育 30 min; P B S 洗 涤 细 胞 3 次 ，进行流式细胞仪分析。或使用上述抗体进行免疫细胞化学染色，观察内皮细胞特异标志的表达情况。

b.乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low-density lipoprotein, Ac-L D L ) 摄取实验：向贴壁培养的内皮细胞中添加l〇lig/ml D H 标 记 的 A c -L D L (DiI-Ac-L D L )， 3 7 ℃培养 4 h 。收集细胞进行流式细胞仪分析或用激光共聚焦显微镜观察分析。

(6) 结果：

a. 磁珠分选的C D 133⁺细胞经流式细胞仪鉴定其纯度为(90±5)%， CD133⁺ 细胞中包 含 的 C D 3 4 ⁺ 细胞的比例为(95±4)%， K D R +细胞的比例为(3±2)%，不含成熟内皮细胞(V W F ， V E -钙黏着蛋白等)或成纤维细胞。

b. 细胞形态变化: 分离所得的C D 1 3 3 ⁺ 细胞接种于纤连蛋白包被的2 4 孔 板 中 ，第 3〜 4 天可观察到梭形贴壁细胞， 10〜 1 4 天出现多个集落，贴壁的梭形细胞开始从集落的边缘出芽长出。培 养 3〜 4 周 后 ，细胞生长逐渐汇合，以长梭形 细 胞 居 多 ，其中散在成片的鹅卵石样细胞。此时细胞扩增了 (11土5)倍。这些 细 胞 不 表 达 C D 1 3 3 , 而表达内皮细胞标志，如 V E -钙黏着蛋白、 V W E 、
UEA-I 等 。

c.通过磁珠纯化的U E A -I+ 细胞具有较强的扩增能力，继 续 培 养 2——3周 ，细胞可扩增(2228±375)倍。这些细胞可表达内皮细胞标志V W F 、 U E A -1、 C D 105、K D R 、 C D 31、 C D 144等 ，不 表 达 C D 45。它们具有内皮细胞的功能—摄取A c - L D L