间 充 质 干 细 胞 的 分 离 培 养 与 扩 增

间 充 质 干 细 胞 的 分 离 培 养 与 扩 增

研究表明，除骨髓外，在外周血、脐血、脂肪、关节滑膜以及骨骼肌和皮肤的结缔组织等多种组织中均发现有 M S C 的存在。骨 髓 中 M S C 的含量很低，一 般 为 0.001%〜0.01%，要 利 用 M S C 就必须实现其在体外的分离培养及扩增。目前，分离培养方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法。下面分别介绍几种适用于不同来源的人的 M S C 的分离纯化及扩增方法。

骨 髓 来 源 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养

1.材料与试剂
骨髓、低糖 D M E M (D M E M -L G ) 、 Percoll 分离液、 IOxPBS、 IxPBS、 MesenCult™培养液、肝素。

2.方法
(1) 无菌条件下采集健康志愿者骨髓，肝素抗凝。

(2) 用 含 10% 胎 牛血清的 D M E M - L G 培养液适当稀释样品， 1500r/min离 心 5 min,弃上清及脂肪层。

(3) 加 入 5m l 含 10% 胎牛血清的 D M E M - L G 培养液，混匀。

⑷ 按 照 I :1 的比例将上述细胞悬液缓慢滴加到密度为 l. 〇 73 g/m l 的 Percoll分离液中 ， 1500r/m i n 离 心 30 min。离心后管内容物分为 3 层 。上层为血小板，中间层为 Perc0Il分离液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色云雾状的单个核细胞层。
1.073 g/ml Percoll 分离液配制方法： 5.4 ml Percoll 原液、 6m ll 〇 xPBS。 二者混匀后，吸 弃 3 0 0 ul混合液。然 后 用 IxPBS 补 齐 至 l 〇 m l， 即 为 1.073 g/ml Percoll分离液。

(5) 吸取云雾状单个核细胞层，加人培养液稀释混匀，离心洗涤 2 遍 。

(6) 用 MesenCult™ 培养液叹 6111 〇 611(：〇.) 重悬细胞，以 2.(^10⁵ 个/〇 112 的细胞密度接种于培养瓶中，置 于 3 7 1 、 5 % CO2、饱和湿度的孵箱内培养。

(7) 48 h 后弃掉未贴壁细胞，更换新鲜培养液。

(8) 以后每 3 天换液一次。

(9) 细胞长到 8 0 % 融合时，用 0.25% 的胰蛋白酶消化。

(10) 按 8xl 〇³ 个/cm2 的细胞密度传代进行扩增培养。

3.结果
用 Percoll液 (l. 〇 73 g/ml) 梯度离心从骨髓中分离单个核细胞，接 种 于 MesenCult™ 培养液中， 72 h 后出现散在的纺锤状贴壁细胞， 1 〇 〜 1 4 天后形成克隆， M S C 贴壁稀疏时，长梭形细胞的两极朝向不规律，细胞排列混乱，细胞之间往往通过突起相连接。约 3 周出现致密的贴壁细胞层，此时细胞的两极开始有规律地排列成束状 (图 4.6)，有的呈漩涡状 。每瓶单层融合的 M S C 用胰蛋白酶消化后平均获得 (5.5±0.17) XlO⁵ 个细胞，将这些细胞再传代培养，扩 增 I2 代后可获得 2.3xl 〇 ⁹ 个细胞，扩增约 4.6xl 〇 ⁴ 倍 。

4.注意事项

(1) 在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的 M S C 外 ，还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等，要得到较均一的 M S C ，必须除去其他细胞。根据这些污染细胞的特性，可采用不同的方式排除它们。对于红细胞，因其不贴壁，可通过换液除去; 对于贴壁细胞，可根据其黏附能力与 M S C 黏附能力的不同，通过调整胰蛋白酶-EDTA的消化时间，保 证 M S C 在短暂的时间内与培养皿底分离，而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养皿底，从 而 使 M S C 得到纯化。

⑵选择合适贴壁时间的细胞。如果选用贴壁时间过早的细胞 (1〜 3 h)，则因贴壁细胞数量太少，使细胞生长困难；如果选用贴壁时间过长的细胞 (超过48 h)，在倒置显微镜下可见大量造血细胞黏附在贴壁细胞上呈集落生长，随着培养时间的延长，会出现贴壁细胞形态多样性，细胞传代周期延长，细胞易老化等现象。

(3) 筛选最适于 M S C 生长的血清。首先血清的质量对于 M S C 的生长非常重要，一定要对不同批次的血清进行比较，筛 选 出 最 适 合 M S C 生长的一个批次。本实验介绍的MesenCult™ 培养細卩是选用了经过筛选的适于M S C 增殖的胎牛血清而配制的，通过传代 培 养 后 M S C 的纯度可高达 9 5 % 以上 (一代和二代扩增培养后的 M S C 的表型一致性分
别 达 到 9 5 % 和 98%)。其次，血清的浓度也很重要，并非浓度越高越好，反而高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子，易引起细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而不利于干细胞生长，一 般 以 5 % 〜 10% 胎牛血清最适合 M S C 生长。

(4) 选择合适的接种密度。细胞接种密度过密，会引起细胞之间的接触抑制；而过稀又会导致细胞分泌的因子不足从而影响细胞的生长。一’般适宜密度为 (4——8)xl 〇 ⁴ 个/ml(艾国平等 2001)。

脐 带 血 来 源 的 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养

脐血干细胞由于取材方便、来源广泛而备受关注。研究表明，来源于胳带血的单个核细胞培养后出现的贴壁细胞有两种表型，破骨样细胞和间充质样细胞 (Lingling et al.2003)。破骨样细胞多核，表 达 T R A P 、 C D 45、 C D 51/C D 6 1 ; 间充质样细胞呈成纤维样，表达 S H 2 、 S H 3 、 S H 4 、 A S M A 、 M A B 1470、 C D 13、 C D 29、 CD49e ，这与骨髓 M S C 完全一致。以下就将脐带血 M S C 的体外分离、纯化、扩增方法做一介绍，为脐带血 M S C的临床应用提供更充足的理论依据和技术方法。

1.材料与试剂
肝素、脐血、 D M E M - L G 、 Ficoll-Hypaque 分离液、甲基纤维素、 IxPBS、 MesenCult™培养液。

2.操作步骤

(1) 无菌条件下采集肝素抗凝的正常人脐血 50——100 ml。

⑵ 与 0.01mol/L p H 7.4 的 PBS 按 I : 1 混匀。

⑶ 再 按 4 : 1 的比例与0.5% 的甲基纤维素混勻，室温静置 30m i n 以沉降红细胞。

(4) 小心吸取上清，离心。

(5) 弃上清，用 P B S 重悬细胞。

(6) 叠加到密度为 1.077 g/ml 的 Ficoll-Hypaque 溶液上， 900 g 离心 20 min。

(7) 取界面层，加 入 P B S 混勻，离心洗涤。

(8) 用 MesenCult™ 培养液 (Stem Cell C o .) 重悬细胞，以 I. OxIO6 个/c m 2 的密度接种于培养瓶中，置 于 37℃ 、 C 0 25 % 、饱和湿度的孵箱内培养。

(9) 1 周后，更换培养基，弃掉未贴壁细胞。

(10) 以后每 3 天 换 液 1 次。

(II) 细胞长到 8 0 % 融合时用 0.25% 的胰蛋白酶和 0.02% E D T A 混合液消化传代，在显微镜下控制消 i 七时间。

(12) 以 8. 〇 xl 〇3个/c m 2 的细胞密度接种于传代培养瓶中以扩增培养。

3.结果
以 Ficoll-Hypaque液梯度离心分离胳带血单个核细胞，接 种 于 MesenCult™ 培养液中 ， 一 周后全量换液，去除未贴壁细胞。有的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞 ，有的脐带血样单个核细胞培养后出现间充质样细胞。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，内含多个核 (图4.7A)。间充质样细胞即为 MSC，胞体呈梭形，最初散在存在，两周后形成包含有几十到几百个细胞的克隆，随着细胞的迅速增殖， 3 周后细胞生长达 80%——90%融合，每个克隆约包含几百至几千个细胞，此 时 的 M SC 呈较均一的长梭形，形态类似于 骨 髓 MSC，但较骨髓 M SC 稍小 (图 4.7B )。 据统计， 6.6xl 〇 ⁵ 个脐带血原代 M SC 在体
外 扩 增 10 代后可获得 9.9xl 〇 ⁸ 个细胞，扩 增 约 i.5xl 〇³ 倍 。

4.注意事项

(1) 当前用于实验和临床的种子细胞主要为来源于骨髓的 MSC，但其数量随着年龄的增长而明显下降。脐血源性 M SC 的优势在于：脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单；对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，易于接受；脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的概率低；由于脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应；脐血中含有的丰富干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的分化能力；不涉及社会、伦理及法律方向的更多争论 ；收集的脐血不仅可作为异基因移植的供体，而且还可将其低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。

⑵ 与 骨 髓 M SC 相比，目前脐血来源的 MSC 仍存在数量少、频度低等问题。据统计 约 有 1/4 的脐带血样单个核细胞培养后出现 MSC， 3/4 的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞。因此，在体外培养过程中，如何消除破骨样细胞的存在，如何更好的对其进行纯化扩增，以获得稳定、均一 的 MSC 仍是今后需努力探索的方向。

脂 肪 来 源 M S C 的 分 离 、纯 化 和 扩 增 培 养

近年来研究发现，脂肪组织中含有能分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的前体细胞 群 ，具有较强的增殖能力和多分化潜能，可称之为脂肪基质细胞或脂肪间充质干细胞(Patricia et al.2001)。

1.材料与试剂

手术器械 (大剪 1 把 、止 血 榭 2 把 、镊 子 2 把 、眼科镊子 1 把 、眼 科 剪 1 把)，筛网 (80目、 2 0 0 目、 4 0 0 目)，平 皿 2 个 ， 50m l 离 心 管 2 个 ， IOml 离 心 管 2 个 。DMEM-LG，PBS，双 抗 ，10% FBS,2% BSA，0.1% 胶原酶，红细胞裂解液 (0.154 mol/LNH4OU 10 mmol/L • KHCO3、 O.lmmol/LEDTA)。

2.方法

⑴将切取的人的脂肪组织放入平皿中，游离血管，用 P B S 冲洗，剪 碎 ，加 入 4 倍体积胶原酶、 1 倍 体 积 B S A 和双抗。

(2) 置 入 50m l 离心管， 37°C 消 化 45 min，并不时摇动。

(3) 将消化成糊状组织的脂肪组织先用 8 0 目筛网过滤，后 用 2 0 0 目再过滤一遍，余下的脂肪组织加入胶原酶继续消化，重复上述操作。

(4) 过 滤 液 8 〇〇 g 离 心 IOmin，去除上清，加入少许含血清培养液，用吸管轻轻吹打，使之成悬液。

(5) 加 入 红 细 胞 裂 解 液 ，室 温 放 置IOmin

(6) 1200r/min 离心 5m i n ， PBS 洗漆2 遍 。

(7) 用 D M E M = L G 培养液 (含 10% F B S ，100U /m l 青霉素， lOOpg/m l 链霉素湩悬细胞 ，接种于培养瓶中，置 于 37℃、 5 % C 0 2、饱和湿度孵箱中培养。

(8) 24 h 后更换培养液。

3.结果
体外培养的脂肪来源的 M S C 易扩增，并呈现成纤维细胞样形态，这与骨髓来源的 MSC—致 (图 4.8)。

4.2.1.4 M A P C 的 分 离 培 养 2 0 0 2 年 ， J i a n g 等从骨髓中分离纯化了一种更为原始的干细胞，称为多能成体祖细(multipotent adult progenitor cell, M APC)(Yuehua et al. 200 2 ，Yukari et al. 2003)。 研究表 明 ， M A P C 具有胚胎干细胞的某些特征，不仅可在体内、外分化成包括 3 个胚层来源的几乎所有组织的细胞，而且具有极强的增殖能力, 体外培养扩增后至少可传 3 0 代以上。
其表面标志为： CD13⁺ 、 CD44^- 、 CD45
^- 、 c - k i t ^- F lk -1 ^dim 和 M H C -IIclass ^- 。

1.材料与试剂

⑴ M A C S 磁珠分选系统。

⑵ 扩 增 培 养 基 组 成 ： 60%DMEM-LG; 40%MCDB-201; Ix 胰岛素-转铁蛋白-砸；Ix 油酸-牛血清白蛋白； 10^-8 m0I/L 地塞米松； 10^-4 moI/L 抗 坏 血 酸 2-磷酸 盐 ； lOng/mlPDGF-BB; I0ng/mlEGF; 2% 胎牛血清。

2.方法

(1) 取健康人骨髓，用 l. 〇77 g/ml 的 Ficoll-Hypaqiie 分离液分离获得单个核细胞。

⑵ 以 Ix lO ⁵ 个/cm 2 的密度接种于纤维结合素包被的培养皿底部，加入上述扩增培养基。

(3) 24 h 后 ，去除未贴壁细胞。

⑷ 细 胞 长 到 8 0 % 融合后，以 5x IO³ 个/c m 2 的密度进行扩增培养。

(5) 继续培养 2〜 3 周。

(6) 收获细胞，利 用 M A C S 磁珠分选去 除 CD45⁺ /GlyA⁺ 阳性细胞。

(7) 然后将洗脱的细胞以 1 0 个/孔的密度接种于纤维结合素包被的 9 6 孔板中培 养 ，细胞密度维持在 (0.5〜 1.5)x l 0³ 个/
c m 2。

3.结果检测

人骨髓来源的 M A P C 形态呈多角形 (图 4.9)，细胞胞质少，胞核周围有颗粒其倍增时间为 48——60 h 。

4.注意事项

(1) M A P C 培养与培养条件、细胞密度、 C O 2 浓度、培养 基 p H 、胎牛血清及培养皿的类型等均有关。

(2) 由于高密度下 M A P C 易分化，因此不同种属来源的 M A P C 的细胞种植密度不同 ：小 鼠 和 大 鼠 M A P C 最 适 密 度 为 500——1000 个 /c m ² , 人 M A P C 最 适 密 度 为 1500〜 3000个/c m ²。

M SC 的 鉴 定

与 H S C 不同， M S C 具有多种标志，具有非单一性的特点。因此目前对 M S C 主要是通过将其形态学特征、多种表面标志及其具有的向骨、软骨、脂肪及神经等多种方向的分化功能这多方面相结合来进行鉴定的。

形 态 学 鉴 定

见本节间充质干细胞的分离培养与扩增结果检测部分。

表 型 鉴 定

由于各个研究小组在标本的来源、分离的方法、检测细胞的代次以及培养条件等方面存在差异，因而检测到的 M S C 标志物之间也存在较大差异。但多数研究显示，M S C 是一群均质细胞，不表达造血细胞、成纤维细胞及内皮细胞抗原。

1.方法
⑴ 取 传 代 扩 增 后 的 M S C ，用 0.25% 的胰蛋白酶消化。

⑵ 收 获 1.5xl0⁶ 个 M S C 细胞，分 成 每 个 E p 管 (1.5 ml)5xl 〇 ⁵ 个 M S C 细胞，洗漆后
重 悬 于 P B S 。

⑶ 分 别 加 入 抗 C D 29、 C D 34、 C D 44、 C D 45、 C D 92、 C D 166 和 H L A 2D R 单克隆抗 体 ，室温孵育30 min。同时设立阴性对照。

(4) 经 P B S 洗 涤 2 次后与 F I T C 标记的二抗避光反应 15 min。

(5) 细胞洗涤后悬浮于 P B S 中 ，流式细胞仪检测。

2.骨 髓 M SC 的表型特征

用流式细胞仪分析 M S C 的表面抗原，结果显示， M S C 均一地表达 C D 166(间质细胞阳性); 黏附分子 C D 29、C D 44(纤连蛋白和透明质酸盐的受体、基质细胞阳性); 而 CD34(造血干/祖细胞及内皮细胞阳性)、 C D 45(白细胞阳性)、 H L A 2D R (抗原呈递细胞及激活 T 细胞阳性) 及荆豆素 (内皮细胞的标记) 阴性。

3.注意事项
由于间充质干细胞的分化可能是随机非方向性的，因此已经分化的间充质干细胞依然具有转化生成其他类型间充质细胞的潜能。再 者 ，个体不同发育阶段的间充质干细胞的表型功能特异性方面存在差异，上述可能是造成对间充质干细胞细胞表型特征存在争议的原因。因此，到目前为止，对 于 M S C 鉴别并没有特异的分子标记，在这些方面还有待于进一步深入研究。

4 . 2 . 2 . 3 功 能 鉴 定
在体外特定的诱导条件下， M S C 可以分化为骨 (A K P 、钙沉积或骨桥蛋白染色)、软骨 (II 型胶原、酸性蛋白聚糖染色)、脂肪 (亲脂性染料 Nile red 或 Oil red 染色)、肌腱、肌肉、神经、基质、肝和内皮等多种细胞。而 形 态 与 M S C 相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。因此我们可根据 M S C 特有的分化潜能对其进行鉴定。具体过程见下述 M S C 的诱导分化。

M SC 的 定 向 诱 导 分 化

骨 髓 M S C 除了参与构成造血微环境，还具有广泛的分化潜能。大量的体内外实验证 明 ， M S C 不仅可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等间质组织外，还可跨越胚层界限，分化为外胚层的神经细胞及内胚层的肝脏细胞等。

M S C 向 骨 细 胞 的 诱 导 分 化

1.材料与试剂
D M E M -L G 、F B S 、10^-7 mol/L 地塞米松、10mmol /L β-甘油磷酸钠和 50ug/ml 维生素 C 。

2.诱导步骤
(1) 取 传 代 M S C ，用胰酶消化成单细胞悬液。

(2) 以 8.0xl0³ 个/c m 2 细胞浓度接种于预先置有盖玻片的 6 孔板内以制备细胞爬片。

(3) 每孔加入 D M E M -L G 培养液，置培养箱中，隔天换液 1 次

(4) 待细胞融合达8 0 % ，吸去孔内培养液。

(5)实验组每孔加人成骨细胞诱导液(含l( 10^-7 mol/L 地塞米松、 10mmol/L β-甘油磷酸钠 和 5〇 ug/m l维 生 素 C )2m l ，对照组每孔加入等量DMEM-LG培养液，置培养箱中。

(6) 每 3 ~ 4 天 换 液 1 次

3) Von Kossa 检测沉积

在骨诱导培养的第 2 1 天 ，用 Von Kossa 方法可检测到钙沉积的情况。镜下观察到Von Kossa 强阳性为较大的黑色结节，成骨细胞因包埋在钙化基质中而见不到清晰的细胞轮廓。

4 ) 免疫组化检测 I 型胶原表达情况

骨诱导培养 2 1 天 ，免疫组化 S P 法可检测到 I 型胶原表达，在结节周围呈黄褐色。

注意事项

M S C 的分化能力会随扩增代数的增高而降低，因而应尽量使用代数较早的细胞。

M S C 向 软 骨 细 胞 的 诱 导 分 化

1.材料与试剂
髙 糖 D M E M 、 F B S 、 6.25|Lig/m l 胰岛素、 6.25pg/m l 转铁蛋白、 1.25|ng/m l 牛血清白蛋白、lmmol/L 丙酮酸钠、5.35ug/ml 亚油酸、50pg/ml 维生素 C 、10_7mol/L 地塞米松、l 〇 ng/ml
T G F -β 、爱茜蓝 (alcianblue)、 II 型胶原单克隆抗体。

2.诱导步骤
(1) 取 扩 增 M S C 以 1.5xl 〇⁸ 个/L 的细胞密度接种于预先放置有消毒处理好的盖玻片的 6 孔板内。

(2) 细胞贴壁后更换培养液。特定的无血清软骨培养液的组成成分为：高 糖 D M E M ，胰岛素 (6.25ug/ml)，转铁蛋白 (6.25ug/ml)，牛血清白蛋白 (1.25ug/ml ，丙酮酸钠 (Immol/L)，亚油酸 (5.35ug/ml)，维生素 C (50ug/ml)，地塞米松 (l 〇^-7 mol/L )。

(3) 转 移 Iml细胞悬液于 15m l 塑料锥形离心管内， 500r/m i n 低 速 离 心 15 min，使细胞形成微团。

(4)叫加入 l 〇 ng/mlT G F -β ，置 于 3 7 ℃ 、 5 % CO2的孵箱内培养。

(5) 每 2——3 天用上述培养基加新鲜的 T G F -β 换液。

3.软骨细胞的鉴定

(1) 爱茜蓝染色：
a. 聚集诱导软骨培养 18、 2 1 天的细胞团经冰冻切片机切成厚度为5um 的切片

b. 甲醇 4 ¾ 固 定 lOmin。

c. 室温下切片用去离子水洗 3 次 ，每 次 2 min。

d. 浸 于 10% 爱茜蓝中室温过夜。

e. P B S 缓冲液洗 3 次后镜下观察细胞形态。

(2) II 型胶原测定：一 抗 为 II 型胶原单克隆抗体。检测步骤与骨细胞的鉴别中 I 型胶原的测定相同。

4.结果检测
在细胞聚集培养 24 h 后 ，加入地塞米松及 T G F -β 的细胞团与管壁分离，并可在试管中持续生长长达 3 〇天。培 养 第 1 8 天 ，切片经爱茜蓝染色可观察到蓝染的软骨细胞 (图4.11A )， II 型胶原弱阳性分布于软骨细胞切片的周边。培 养 第 2 1 天 ， II 型胶原呈强阳性
(图 4.11B )

M SC 向 脂 肪 细 胞 的 诱 导 分 化

M S C 在 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和消炎痛等诱导下可向脂肪组织分化。分化的细胞可表达过氧化物酶体增殖激活的受体_2(p p a R -2)、脂蛋白脂酶和脂肪酶结合蛋白 aP2 , 且在细胞内出现富集的脂质小泡。在该培养条件下，约 95% 的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞。

1.材料与试剂
高 糖 D M E M 、 F B S 、地 塞 米 松 1umol/L 、胰 岛 素 l〇 m g /L 、 O.5 mmol/L l -甲基-3-异丁基-黄嘌呤、100umol/L 吲哚美辛、2 % 油 红 o(称 取 2 g 油红干粉溶于 IOOml 的 7 0 % 乙醇中，研 磨 ，过滤，室温保存)。

2.诱导步驟

(1) 取体外扩增培养的 M S C ，置于孔板或培养皿中。

(2)当细胞贴壁生长达到8 0 % 融合时，加入脂肪诱导试剂：含 地 塞 米 松 、胰 岛 素 10m g /L ， 0.5 mmol/L l -甲基-3-异丁基-黄嘌呤， l〇〇 umol/L 吲哚美辛，置 于 37℃，5 % C O 2 的孵箱内培养。

⑶ 对 照 组 加 常 规 培 养 液 (D M E M ⁺ 10%FBS)

(4) 每 3〜 4 天换液一次。

3.油 红 〇染色

(1) 取 诱 导 培 养 组 和 未 诱 导 培 养 组 的 细甲醇固定 2 min。

⑵ 7 0 % 乙醇漂洗。

(3) 加 入 2 % 油 红 O 染料染色，室 温 5 min。

⑷ 弃 去 染 液 ，7 0 % 乙醇漂洗后, 用水冲洗。

(5) 苏木精复染 lmin。

(6) 镜下观察脂肪细胞形态及染色情况

4.结果

M S C 原代培养成脂诱导 7 天后，细胞胞质内开始出现细小脂滴；诱 导 1 4 天后细胞胞质内形成高折光性的脂滴，脂肪细胞主要集中在克隆中心，提高放大倍数可清晰地观察到胞质内的脂滴；而且随着培养时间的延长，诱导培养 2 1 天 ，脂肪滴逐渐增大可充满整个细胞，当加人油红 O 染液显示胞核呈蓝色，脂滴呈橙红色 (图 4.12)。脂肪细胞平均占 (88±4.6)%。对于对照组进行光镜下观察和油红 O 染色均未见脂滴。

M S C 向 心 肌 细 胞 的 诱 导 分 化

5-氮胞苷 (5-azacytidine， 5-aza) 可在体外诱导 M S C 分化为心肌样细胞。研 究表明，5-aza 是一种去甲基化药物，它可以与控制向心肌分化的特异启动子基因上的阻遏蛋白结合 ，使其去甲基化，发生构型改变，从而启动干细胞向心肌的分化。

1.材料与试剂

5-aza、 羊抗肌钙蛋白 I (troponin I， TnI) 多克隆抗体、小鼠抗人结蛋白 (desmin) 单克隆抗体、小 鼠 抗 人 G A T A 4 抗体、羊抗连接蛋白 connexin4 3 抗体、兔 抗 山 羊 IgG-FITC和抗小鼠 IgG-TRITCo

2.诱导步骤
⑴ 取 分 离 培 养 后 3 代 人 M S C 细胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化。

(2) 以 2xl0⁵ 个/c m 2 的密度接种于 2 4 孔塑料培养板中。

(3) 在完全培养液中加入 3umol/L、 5umol/L 、 lOumol/L 5-aza。

(4) 诱导分化 24 h 后 ，吸弃培养液。

(5) P B S 清 洗 2 次 ，继续用不含诱导剂的完全培养液培养。

(6) 每 2——3 天 换 液 1 次。

(7) 光学显微镜动态观察诱导后不同时间的细胞形态变化。

心肌细胞的鉴定

1.细胞免疫荧光检测

⑴ 细 胞 爬 片 用 P B S 洗 涤 2 次 ，每 次 5 min。

⑵ 4 % 多聚甲醛室温固定 b m i n 。

(3) P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。

⑷ 含 0.1% Triton 和 0.3% H 2O 2 的甲醇溶液封闭 lOmin，以消除内源性过氧化物酶。

⑶ 蒸 馏 水 冲 洗 ， P B S 浸 泡 5 min。

(6) 山羊血清工作液室温孵育15 min。

(7) 去血清后分另Ij 加 cTnl(心肌特异性肌钙蛋白 I 特异性抗体) 和单克隆抗体工作液5 〇 ul，置于湿盒中 4℃ 过夜。

(8) P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。

(9) 滴加荧光标记的二抗 (兔抗山羊 IgG-F I T C 和抗小鼠 IgG-TRITC) 工作液， 37℃孵育 30 min。

(10) P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。

(11) 直接在灰光显微镜下观察结果。

2.R T - P C R 检测分化细胞心肌特异因子β-M H C 的表达

分别提取 2、 7、 11 代未诱导的 hMSC(对照) 和 lOumol/L 的 5-aza 诱导后 2 1 天的细胞总R N A ，逆转录后进行 PCR。 AMHC 基因全长 688bp，根据全长设计 PCR 引物：上游5^ATCAAGGAGCTCACCTACCAG-3,下游引物： 5:TCGACAATGTGTCCGAGGTC-3、同时用 GAPDH 作参照。

结果

1 ) 形态学变化
经 5 umol/L 、 l〇umol/L 的 5-aza 进行化学诱导后细胞形态变长，体积增大，诱导后1 4 天 时 2 0 % 的 Siamol/L 浓度组细胞及 3 0 % 的 lOumol/L 浓度组细胞出现细胞融合形成多核肌管样结构；诱 导 后 2 1 天时细胞出现分叉，呈树枝样 (图 4.13)。 3umol/L 浓 度组 h M S C在诱导后细胞形态略长，未出现肌管结构^ 3 组 中 3umol/L 浓 度 组 h M S C 细胞增殖最强，lOumol/L 浓度组细胞发生细胞空泡样变性的比例较大，而且细胞增殖能力下降
 

2 ) 细胞免疫荧光染色结果

细胞核经 D A P I 衬染后在紫外光激发下呈蓝色荧光。对照组未经诱导的 M s c 胞质内不表达单克隆抗体和 cTnl，细胞不着色；而 诱 导 后 2 3天 ， I 5 、 10umol/L 浓 度 组 hMSC可见单克隆抗体表达阳性 (红色荧光)， C T n I 表达阳性 (绿色荧光)，心肌早期转录因子G A T A 4 染色阳性 (红色荧光)、 连接蛋白 connexin4 3 的表达阳性 (绿色荧光)(图 4.14)。 后 3种蛋白质的阳性染色提示 hMSC 经过诱导后可以向心肌细胞分化，并具有心肌细胞特有的结构蛋白。

分别随机取 5 个高倍视野，进行细胞计数， lOumol/L 组 的 cTnl 阳性染色细胞数目 (65.3±4.7)% 高 于 5umol/L 诱导组 (48.2 土 5.4)% (P<0.05); 3umol/L组MSC cTnI等特异性蛋白阳性染色细胞低于5 % ，阴性对照组各种抗体染色均为阴性。

3) RT-PCR 结果
h M S C 经 5-aza诱 导 后 2 1 天所分化的心肌样细胞经R T -P C R 显示，诱导后细胞在m R N A 水平表达心肌细胞特异肌凝蛋白重链β-M H C ，而未经诱导的M S C 无β-M H C 的表达

注意事项

(1) 经 5-aza诱导后M S C 可以出现肌系细胞的蛋白质表达及心肌特异性基因岸M H Cm R N A 表达，表 明 M S C 具有向肌系细胞分化的能力。由于诱导后的细胞在形态及功能上与成熟的心肌还存在一定差异(如未能观察到诱导细胞的自发搏动)，故 称 为 「心肌样细胞」。

(2) 5-aza诱 导 MSC分化为心肌细胞的效率较低，因此如何提高诱导效率及明确甘分化机制等难题亟待解决。

M S C 向 神 经 细 胞 的 诱 导 分 化

1.材料与试剂

3umol/L β-巯基乙醇、 2 % 二甲基亚砜(DMSO)、 200umol/L 丁化羟基苯甲醚(BHA)、鼠抗人的神经丝蛋白 (NF)、神经元特异性烯醇化酿N S E )单克隆抗体和甲苯胺蓝 。

2.操作步骤
(1) 取 体 外 扩 增 的 MSC， 以 8.0x l〇³ 个/cm2的细胞密度接种于 6 孔板中，培养条件为 DMEM+10%FBS

⑵ 当 细 胞 达 到 60%〜 70% 融合时，用 3umol/L β- 巯 基 乙 醇 预 诱 导 施 ，培养条件为D M EM +20% F B S

(3) PBS洗涤后，再用2% 的二甲基亚砜(DMSO) 和 200^imol/L 丁化羟基苯甲醚(BHA)进行正式诱导。

(4) 每 隔 30 min观察一次，直至细胞形态无明显变化。

(5)同时采取另一种诱导方法进行诱导，即用同样的方法预诱导后再分另Ij 用 含 1、 3、5 、 7 、 lOumol/L BME 的 DMEM 培养液代替含 2 % DMSO 和 200|amol/L BHA 的 DMEM培养液诱导MSC。

神经细胞的鉴定

1 ) 免疫组织化学染色

分别取诱导2 h 、 4 h、 6 h 、 12 h 后的细胞爬片，参照HistostainTM-SP(链霉卵白素-过氧化物酶)试剂盒操作方法进行免疫组织化学染 色 。 一抗为鼠抗人的神经丝蛋白 (NF) 和神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体，二抗为羊抗鼠 IgG。 阴性对照用0.01mol /L 的 PBS
代 替 NSE和 N F单克隆抗体，实验对照用未诱导的MSC细胞爬片直接进行N F 和 NSE免疫组织化学染色。

另取诱导后4 h 、 6 h 、 8 h 的细胞爬片，用甲苯胺蓝染色，观察尼氏体。染色步骤如下：
⑴ 细 胞 爬 片 用 P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。

(2) 10% 中性福尔马林固定30 min， PBS洗 涤 30 min。

(3) 0.5% 的甲苯胺蓝染色3 min。

(4) 去离子水洗。

(5) 95% 乙醇分色，显微镜下控制分色时间至细胞结构清晰为止。

(6) 100% 乙醇脱水2 次 ，每 次 2 min。

(7) 二甲苯透明lOmin。

(8) 中性树胶封片。

(9) 显微镜下观察结果。

2) MSC向神经细胞诱导后Ak幼Vx基因的检测

提取诱导后细胞的总RNA， 逆 转 录 后 进 行 PCR。 AW如 基 因 全 长 495bp。 根据全
长设计 PCR 弓丨物：上 游 ： 5， -AGAGGGGAATTCCTGGAG-3，； 下 游 ： 5， -CTGAGGACCAGGACTCTCTCT-3、 同时用 GAPDH 作 参 照 。

结果判定

I) MSC向神经细胞转化过程中的形态变化
在 预 诱 导 后 12 h发现原来大而扁平的M SC胞体发生收缩，细胞边缘变的不规整，有许多细的指状突起，（图 4.15)。 预诱导结束时，一部分细胞胞体已变成近似圆形。正式诱导后的3 h 内细胞发生了明显的形态学变化，细胞胞体进一步收缩，形成圆形、不规整的锥形、. 三角形，有的细胞有多个突起，而且发出分支，终末端有类似神经元细胞的终 结 ；有的突起逐渐伸长，形成圆锥状终末端，类 似 于 Golgi I 型神经元的长轴突(图4.15B〜 F)， 5 h 后细胞形态基本不再发生明显变化，有 80% 以上的细胞呈现典型的神经元样表型。

分 别 用 含 1、 3 、 5 、 7 、 10umol/L A 巯基乙醇的 D M E M 培养液诱导M S C ，均可观察到典型的神经细胞，只是转化率较用含2 % D M S O 和 200pmol/L B H A 的 D M E M 培养液诱导时低。

2 ) 免疫组织化学和组织化学染色结果

在 诱 导 M S C 向神经细胞分化过程中，取 诱 导 2 h 、 4 h 、 6 h 、 12 h 后的细胞爬片，检测 N S E 和 N F 的表达情况。观察发现，未诱导的M S C 不表达N S E 和 N F ，细胞不着色(图4.16A、 C )Q 诱导后不同时间的细胞均有N S E 和 N F 表达。阳性细胞呈棕褐色。 N S E 阳性细胞表现为弥漫性胞质着色(图 4.16B); N F 在核周和突起均有表达(图 4.16D)。不同扩增代数的骨髓M S C 向神经细胞分化后均表达N SE 和 NF。 不同代数的MSC分化过程中N S E 和 N F 阳性率 (显微镜下记数100 个细胞中N S E 和 N F 阳性的细胞数，分别随机记数5 次)，经统计学分析无显著性差异(P >〇. 〇 5)
 

甲苯胺蓝染色发现，诱 导 6 h 和 8 h 后的神经细胞的胞质中存在着深蓝色的块状或颗粒状的尼氏体 (图 4.17)。

3) Nestin 的检测
未诱导的M S C 不表 达 Nestin, 诱 导 5 h 后的细胞表达Nestin，电泳后出现495b p 的特异性片段(图4.18)