方案7 垂直SDS 平板凝胶制备：同时灌制多梯度凝胶实验

对于分离宽分子量范围的蛋白质，梯度 SDS-PAGE 凝胶可提供最佳分析方法，产生更清晰的蛋白质点。通过减少凝胶中孔的尺寸，可使扩散减少。但是，梯度凝胶重复性较差，所以通常用多凝胶灌制装置来同时灌制，制作一套凝胶来进行同一系列的实验。下面讲述用多凝胶灌制系统灌制梯度凝胶的方法。

如果凝胶要用银氨方法（方案 11) 来染色，凝胶中的硫代硫酸钠可减少染色背景（HochstrasserandMerril,1988; 见表 4.6 注释）。

1.安装玻璃板之前，用乙醇浸过的无棉纸巾擦拭玻璃板，确保无灰尘颗粒粘在玻璃板表面。

实验提不：处理玻璃板的过程中要戴手套，以减少角蛋白和其他蛋白的污染。

2.对齐两块玻璃板，在两边放入 1.0mm 或 1.5 mm 隔板。

3.用不脱色的记号笔标记玻璃板距上沿 0.5 cm 处，在一些系统例如 Bio-Rad ProteanII，玻璃板不等长，应确保标记距短板上沿0.5 cm。

4.用打字机或铅笔标记一小条滤纸作为凝胶的标签。将滤纸放在凝胶框的左边底部。不要用记号笔，因其会渗人凝胶。

5.将整个凝胶框放人多凝胶灌注架中，同样将其他的凝胶框排列放于灌注架上，用薄塑料片（即隔板）将各凝胶框分隔开。这些薄片通常由多凝胶灌注架提供，但也可用聚酯薄膜板切割而成。用灌注架提供的隔板填充各个空格。夹紧灌注架上前面的玻璃板以确保垫片将灌胶空间密封好。

6.灌胶之前，向灌胶的空间加水来确定所需试剂的体积，测量体积的一半用于制备低（轻溶液），另一半用于制备高（重溶液）。用表 4.6 来计算灌胶中各个成分的体积。

7.制备准确体积的轻、重丙烯酰胺溶液，过硫酸铵与 TEMED 的体积忽略不计，各加一个小的磁力搅拌子。

8.用水抽真空泵来抽去丙烯酰胺中的气体（几分钟），同时在磁力搅拌器上搅拌。

虽然并非所有研究者都进行这步抽真空，但为了更佳的重复性，建议进行此步操作。

9.当溶液在抽真空时，将一根管子连到蠕动泵，先用水检验以确保制造商所建议泵的流速。一旦流速固定，将管一端连在梯度混合器的出口，另一端连到多块凝胶灌注仪的人口。在多块凝胶灌制装置的开口端放一个夹子，打开夹子，确保梯度混合器处于关闭的状态。

10.在混合器中将小磁力搅拌子放人，将梯度混合器放在磁力搅拌器上。