通 过 280nm 吸光度测定抗体浓度

通 过 280nm 吸光度测定抗体浓度

测定纯化的抗体浓度的最快捷的方法之一是测定其在 280nm(A280） 处的吸收。对于这个，需要一台紫外分光光度计来检测在紫外区内的光传递。那些含有芳香族氨基酸残基 (色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸）的蛋白质会在波长约为 280nm 处吸收光线能源。依据这三种氨基酸的已知数值，每种蛋白质都有其自己的消光系数。对于免疫球蛋白，其成分的差异在很大程度上可以被忽略。吸光度越大，其蛋白质浓度越高。为获得满意结果，抗体纯度需要大于 9 5 % 。

一、操作步骤

(1) 打开分光光度计并设定光波长为 280nm。

(2) 稀释样本使蛋白浓度估计为 0.5〜1.5 mg/ml。如果样本的浓度很高，准备两个不同的稀释（如 1 : 5 和 1 : 10) 来确认结果。

(3) 在比色皿加人稀释液。当分光光度计预热足够时间后，插入装有稀释液的比色皿并调至读数为「0」。

(4) 倒出比色皿中的稀释液，向滤纸上扣干。再向比色皿中加人足量的稀释的待测抗体样品，稍微混合一下并倒掉此样品，再加人稀释的待测抗体样品于比色皿内。插人分光光度计。记录数值。

(5) 倒掉样品。如果还有浓度更高的此待测样品，加人比色皿内。如上述操作，稍微混合一下后倒掉，再加入此待测样品并插入分光光度计，记录数值。

(6) 计算稀释样品的浓度。样品的吸光度数值除以表 7. 2 中所列的恰当数值，这个图表表明浓度是1.0mg/m l抗体它的吸光度数值应该是多少（消光系数）

(7) 因 此 ，如 果 一 个 Ig G 样 品 的 吸 光 度 是 0.75, 那 么 它 的 浓 度 为 0.75/1.36 =0.55 mg/ml。如 果 是 1 : 5 稀 释 的 原 样 品 这 种 情 况 ，那 么 原 样 品 的 浓 度 为 0. 5 5X 5 =2.75 mg/ml。

二、DS-PAGE

SDS 是一种阴离子去污剂，它 通 过 「包 裹 ，，多 肽 骨 架 使 蛋 白 质 变 性 。 SDS — 般以1.4: 1 的比率与蛋白质特异性结合 [1度]。这 样 ，SDS 使整条多肽链都带负电荷（这样变性的多肽链就变成一条负电荷的「棍子」，相同长度多肽链电荷相同）。要根据分子大小将蛋白质分离，通常需要对蛋白质的二硫键进行还原。可 用 2-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)对蛋白质进行还原。因此，在 变 性 的 SDS-PAGE 蛋白质分离物，迁移率并不取决于蛋白质原有的电荷量而是由相对分子质量的大小决定的。样品通常以变性和非变性两种条件进行电泳。

有许多公司生产电泳槽, 凝胶及电泳系统。我们建议的总的选择原则是越简单、越防漏的装置越好。下面内容只是一个例子而并不是必需遵照的。

三、仪器设备

Biorad Criterion 胶槽

Biorad 胶支架

Fisher Biotec 电泳系统

四、试剂

电泳缓冲液： 50 mmol/L Tris 减 ，50 mmol/L Tricine，0. 1%SDS

5 X 非还原上样缓冲液： 62. 5 mmol/L TriS-HCl，1 0 % 甘油，2 % SDS, 0.025 % 溴酚蓝

5 X 还原样本缓冲液： 62. 5 mmol/L Tris-HCl，1 0 % 甘 油 ，2 % SDS，0.7mol/L 2-琉基乙醇，0.025% 溴酚蓝

抗体稀释缓冲液： 150 mmol/LPBS

五、操作步骤

(1) 准备一个要检测的天然（非还原的） 及还原的样本材料。在两个小管上分别标记为还原和非还原样本。向每个小管中加入 ZjLig的抗体。

(2) 向每个管中添加足够的PBS 使总体积为 20W。

(3) 对于非还原的样本，加 人 5jul 非还原样本缓冲液; 对于还原的样本，加 5ul 还原样本缓冲液。用漩涡混合器充分将每个样品混匀。

(4) 为了断裂抗体的 H 链 和 L 链之间的二硫键，还原的样品在上样于凝胶之前需要煮 沸 2 min。非还原的样品则不需要煮沸。

(5) 在加样于凝胶之前，按照所有生产商推荐的步骤进行操作。这包括用去离子水(DI H₂O) 洗涤凝胶及切掉底部的凝胶。

(6) 将凝胶及其支架放置到电泳装置中。保证凝胶腔室是密封的。将 小 室 填 满 SDS电泳缓冲液。

(7) 样本加样于凝胶加样孔中。凝胶应划分为两部分。第一部分加非还原样品；第二部分加还原样品。每一部分的第一个孔应加相对分子质量标准。在每一部分以同样的顺序加每一对非还原/还原样品于凝胶孔内。在笔记本上记录加样顺序，或者按照标准的操作程序进行加样顺序。

( 8 ) 向孔中加样完毕后，盖上电泳槽盖使其与正确的电极连接。打开电源将电流调至 60mA。让凝胶运行大约 30 min, 蓝染料指示剂应该移至凝胶的底部但不能跑出。运行结束时关闭电源，拔掉电极。

(9) 取下电泳槽盖，拿出凝胶。倒掉电泳缓冲液。

(10) 将凝胶转至一个浅的塑料容器内。在去离子水中漂洗凝胶三次。漂洗第三次后 ，加适当的染色剂来显现蛋白质，如考马斯売蓝（coomassie blue) 或凝胶蓝（gel blue) 。凝 胶 染 色 15 min。

(11) 根据所用的染色剂用乙酸/ 甲醇或者去离子 H₂0 进行脱色。

(12) 脱色后，将凝胶放置于一个硬玻璃表面来观察。凝胶可通过密封或者干燥进行长期保存。最好是用凝胶成像系统将胶作一个永久的记录，也可对凝胶进行扫描以做进一步的分析。

SDS-PAGE 分析（图 7. 8) 能够显示抗体的完整性和稳定性。在 分 析 F (ab)和 F (ab%片段时，它也必不可少。完整的抗体与 150kDa 蛋白质标准的迁移位置基本一致，如果有抗体碎片，那么将会在浓的抗体条带下面看见弱的条带。如果有聚集物，将会在加样孔下与浓的抗体条带之间看见这些条带。在还原的那一边，纯化的抗体样品中应有两条不同的条带: 一条是在 50kDa 蛋白质分子质量标准处，是抗体重链；另一个在 25kDa 蛋白质分子质量标准处，是抗体轻链。