蛋 白 质 L 亲和层析

蛋 白 质 L 亲和层析
蛋白 质 L 对 Ig s 的 X 轻链具有高亲和力，可纯化完整抗体和抗体的片段。因此，可用其 对 IgM 和 Fab 及 F(ab); 片段进行纯化。除了这些特性，我们还发现纯化结果不稳定，并且其半衰期短。但 是 ，蛋 白 质 L 是一种替代型「广谱」抗体纯化基质。蛋 白 质 L 与免疫球蛋白的 K 轻链结合，这对于纯化抗体片段及完整的 IgG、IgM 和 IgA 很有用。

一、试剂

结合缓冲液： 10mmol/L PBS，pH 7. 4

2 X 结合缓冲液： 20 mmol/LPB S，pH 7. 4

洗脱缓冲液： 100 mmol/L 柠檬酸缓冲液，p H 3.0

中和缓冲液： 1.0mol/LTris

透析缓冲液： 150 mmol/L PBS，pH 7. 6

二 、 操作步骤

(1) 用 2X 结合缓冲液 I : 1 稀释澄清的抗体上样原液。只需准备当天要纯化的样本量 。剩下的抗体上样原液何时纯化再何时稀释。

(2) 抗体上样原液第一次上样时，我们建议过量上样。保留流出液因为其中将仍含有抗体。这种做法的目的是确定你所准备的柱子对准备纯化的完整抗体或者抗体片段的最大结合量。

(3) 加样后，收集并保留抗体上样原液流出液及第一次洗柱的液体。用结合缓冲液洗柱直到监测器返回基线为止。

(4) 用洗脱缓冲液洗脱结合的抗体。将紫外分光光度计设置〇D= 2 8 0 nm，在此波长处测定洗脱下来的抗体量 (参见「抗体浓度的测定」）。依据此数据，便可知道层析柱的抗体结合量，以进行剩余的抗体纯化。

(5) 完成先前所述纯化程序后，依据抗体上样原液的中抗体含量的估算，将所有或者一部分流出液返回此柱。

(6) 用结合缓冲液洗去未结合的物质。当监测器返回基线时，直接 洗 脱 抗 体 于 Tris中和缓冲液中。

(7) 当所有抗体已洗脱完、监测器已经平稳后，加结合缓冲液于柱内。当监测器达到基线时，柱子可用于重新上样。

(8) 将洗脱下来并已中和过的抗体保存于4°C 以便与再次纯化的抗体合并。

(9) 继续上样并洗脱结合的抗体直到将所有抗体纯化完。

(10) 集 中 所 有 洗 脱 抗 体 并 对 PBS溶 液 透 析 。可 进 一 步 浓 缩 抗 体 到 终 浓 度 2 〜10 mg/ml
(依我们的经验, 此基质半衰期短，最多只用 1 0 次以后，柱的结合力减至一半。）
蛋 白 质 A 、蛋 白 质 G 及 IEC 对于上述纯化程序最具有大量纯化抗体的能力。可制备大柱子：购买的纯化材料越多，那么每单位的材料就越便宜。用这三种基质装柱，纯化柱的大小基本上没有限制。许多商品柱可容纳数升至数千升的纯化产物。

四、经济上的考虑

在实验室或者抗体纯化中心，SEC 纯化柱的高度只有房间天花板能限制。诚 然 ，非常大的柱子能处理大体积的抗体上样原液, 尽管纯化柱的制备中的问题可能会降低柱子的纯化效率。山羊抗鼠 IgM 和 蛋 白 质 L 基质的成本并没有因其量的增高而显著减少。如果纯化克级的 IgM 单克隆抗体需要一个大柱子，那么购买高质量的山羊抗-鼠 IgM 抗体与活化的琼脂糖凝胶微珠进行交联可能会比较经济。
除了上述方法，还有其他方法也可以用于抗体纯化，包括聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG) 吸附、轻憐灰石 色谱法（hydroxyapatite chromatography) 和疏水作用 色谱法(hydrophobic interaction chromatography)。
抗体的最终用途将决定其被纯化的方法。对于快速廉价的纯化，沉淀法是足够的。如果用于诊断，蛋 白 质 A/G 纯化的抗体能提供好的检测结果的重复性。如果用于临床前期研究，蛋 白 质 A/G 纯化的抗体再用 IEC、SEC 或者疏水作用色谱法进一步纯化将得到高度纯化的抗体。对于任何临床前期和临床应用，抗体纯化必须在无菌和低内毒素的条件下进行，必须符合当地（如食品和药物管理部门）的法定操作程序。因此，对于每个实验室 ，每种抗体应该确定一种纯化策略。