方案1 构筑学：尼氏颗粒和髓鞘实验

构筑学分析所必需的现代组织学技术直接来源于 Weigert 和 Nissl 所采用的方法和技术^首先，看一下尼氏（Nissl) 方法，1886 年，Ehrlich 介绍了用亚甲基蓝作为神经细胞染色的重要方法（图 15-1A), 这种方法很快被 Nissl 用在乙醇固定的脑切片上 (1894)。或许具有讽刺意义的是，Nissl 当初拒绝对嗜染物质的化学本质进行推测，而集中在它的详细结构排列，并且按一些不同的类型为其命名（Clarke and O'malley1996)，今天当其化学本质得到了公认（核糖体中所含的 RNA), 我们将其称为尼氏颗粒。与其他方法相比，此方法本身仍具有不可替代的重要性，在局部解剖图的构建、电极放置和实验损伤位置的确定时作为参考标准，并作为高尔基和细胞内染色的衬染（见第一章)。尼氏染色可以用各种碱性染料，产生从红色、粉红、紫色到蓝色的颜色谱。

Windle、Rhines 和 Rankin(1943) 综述了一些染料，推荐用硫堇巴比妥_醋酸盐缓冲液 (pH3.65)。1955 年 Powers 和 Clark 介绍用焦油紫来做尼氏染色，并推荐醋酸盐缓冲液（pH3.5)。

在最初的髓鞘染色中，Weigert 使用酸性品红染料-苯胺的衍生物磺酸三芳基甲烷, 但目前为人所熟知的方法是用苏木素的衍生法，如 Weigert-Pal。

Weigert 只能通过延长重铬酸钾固定组织的时间获得染色，其机制可能是由于染料与铬之间形成了复合物或离子键，而重铬酸钾则是作为染料的媒染剂和脂质的固定剂（Baker1958)，最后使用碱性乙醇进行分色。在例 1 中我们用铬花青 R(搔洛铬青),Page 曾用作髓鞘染色（1965L 与酸性品红相同，铬花青 R 也是一种三芳基甲烷化合物，在 pH1.5 下与含铁离子的媒染剂一起使用，可以与铁离子形成一些化合物，最稳定的是 [Fe²（染料)]^2-(Kiernan1984a,b)。

一、固定

1.按照第一章例 2 的方法进行全身灌注，但换用甲醛盐水（在 0.85% 盐水中含 4% 甲醛).3

2.取脑，储存于新鲜的甲醛盐水中。

3.用单面刹刀手工切约 2 mm 厚的冠状切片。

二、脱水和包理

1.梯度乙醇脱水（70%、95% 和 100%)，每 4 h 换 3 次，在组织清洁剂（nationaldiagnostics) 中每 4 h 换 3 次，或直至透明。

2.浸入融化的石蜡（55X：) 中，每 8 h 换 3 次进行包埋。

三、切片和染色

1.切 10um 的切片。

2.用组织清洁剂去除蜡，切片经梯度乙醇水化（100%、95% 和 70%)。

3.染色（注意本例中不同的切片分别用了几种不同的染色方法)。

尼氏颗较

（1）最原始的尼氏染色非常具有退行性，也就是说，组织先被过度染色然后分色，退行的技术仍然是许多现代方法的特征；

（2）用 0.1% 的醋酸焦油紫染色 20s(染色的时间取决于染料的来源、溶液的存放时间和 pH、组织的存放时间和其他可能的因素）；

（3）梯度乙醇脱水（70%、95%和 100%), 用组织清洁剂使其透明；

（4）用 95% 乙醇分色以降低背景染色；

（5）100% 乙醇脱水完成，切片再用组织清洁剂透明。如需要，可以重复步骤 c。

髓鞘（Kieman1984b)

（1）用铬花青 R 染色 15~20 min[0.21mol/L 含水氯化铁 20 ml(5.6%w/w FeCl3.6 H20); 格花青 Rig;H2SO4(95%~98%w/w)2.5 ml; 力口水至 500 ml];

（2）流水去除多余的染料；

（3）氯化铁（5.6%) 分色；

（4）流水洗 5 min;

（5）可用 0.5% 核红衬染尼氏颗粒；

（6）梯度乙醇脱水（70%、95% 和 100%), 用组织清洁剂透明。

4.用 DPX 封片。

四、结果

用醋酸焦油紫染色后，神经元的核周体和近侧树突布满略带紫色的尼氏颗粒，神经元的常染色质核未着色，但每个神经元中单个突出的核仁染色较深。胶质细胞、室管膜和内皮细胞的异染色质核染色深，密度约与染色质浓缩的程度成正比。铬花青 R 染色后，髓鞘呈深蓝色，神经纤维网呈灰色背景。坏死的细胞和红血球染色较深，因此，充分的灌注固定对于染色结果至关重要。