16S R N A 靶向变性梯度凝胶电泳指纹 图谱分析微生物菌群实验

疏水面的水将滑落)。

5.用滚筒固定胶贴后移去纸保护层。

6.用纸巾轻轻吸干胶贴。

7.用 9 6 % 乙醇清洗分隔条，并放于胶贴的左右两侧。

8.将小玻璃板放在上方。

9.用夹子夹住玻璃「三明治」，并 放 人 「三明治」支架。

10.按下衬垫，并拧紧压板的螺丝。

11.将玻璃「三明治」放在橡胶密封垫上，并按下手柄。

12.用移液器加人凝胶「塞」。

3.4.2 凝 肢 「塞 」 制 备

在制备主要的分析梯度凝胶前，需 在 D G G E 玻璃板盒底部做一个〇 % 变性剂 P A G 凝 胶 「塞」 — 防止底部泄露。制备凝 胶 「塞」的主要方法如下：

1.确保凝胶架处于水平；必要时调节底部的螺丝。

2.如下制 备 「塞」溶 液（一块凝胶体积）：3.5 m L 〇 % 变性剂， 8 % P A G 溶液4.5 T E M E D15 p-L 1 〇 % (W /V ) 过 硫 酸 铵（A P S )

3.通过橡胶密封垫一边加人 I m L 「塞」溶 液（见注释 7)。

4.「塞」溶液放置 lOmin。

5.灌人梯度凝胶和浓缩胶。

3.4.3 制 备 凝 肢

1.从低到高浓度梯度凝胶和浓缩胶按表 2 混合配置，操作在冰上进行（见注释 8)。

2.用软化水清洗梯度制备仪和连接管道，打 开 泵（流 速 为 19 m L /min) , 抽干系统 。

3.关闭梯度制备仪各室之间的开关。

4.用纸巾吸干各室。

5.当凝胶溶液冷却后，加 人 10% A P S 至高浓度和低浓度的变性剂溶液。

6.在右室加入高浓度溶液，在左室加入低浓度溶液。

7.开始搅拌，打开开关，并立即启动泵保持流速 4. 5 m L /min。

8.将针头放于两块玻璃板间。

9.当凝胶灌注结束后，关掉泵，转移至 Erlenmeyer 烧瓶。

10.用软化水清洗各室，启动泵抽干系统。

11.加 10% A P S 到浓缩胶中。

12.关掉各室间的开关，在右室加人浓缩胶。

13.将针头放于两块玻璃板间，启动泵，保持流速为 3 m L /min。

14.灌完浓缩胶后，插人梳子，让其凝固形成加样孔。避免气泡产生，否则会在条带中出现凹陷。
3.4.4 电泳

1.在电泳槽中加人〇.5X T A E 缓冲液。

2.在电泳前至少 90m i n 打开 Dcode，以便缓冲液在 6 〇- c 达到平衡。

3.在 I h 的聚合后，轻轻拔出梳子。

4.用软化水清洗孔内和孔上未聚合的凝胶，并 轻 敲 「三明治」。

5.关掉 Dcode，打开盖子。

6.拿 出 「三明治」，放人电泳槽中。

7.打开 Dcode, 直至上缓冲室充满缓冲液。

8.关掉 Dcode, 打开盖子。

9.用充满缓冲液的注射器和针头清洗所有加样孔。

10.在加样孔中加入样品（见注释 10)。

11.盖上盖子，后打开 Dcode。

12.打开电源， 200 V 电泳 10 m i n 后，调至 85 V 再电泳 16 h。

3.5 凝 胶 染 色（见 注 释 1 1 和 12)

1.关闭电源。

2.从板上移出凝胶，放人不锈钢托盘中。

3.加入 200 m L lXCairns』固定液，摇 晃 3 min。倒出并回收利用。

4.向托盘中加入 200 m L 银 染 溶 液（注意戴手套），摇 晃 10 min。

5.弃 掉 溶 液（见注释 13)。

6.用软化水清洗托盘。

7.加人新鲜的软化水并振荡 2 min。

8.弃掉废水。

9.用软化水清洗凝胶和胶贴。

10.将凝胶放人用于盛显影液的不锈钢托盘。

11.加入少量的显影液并轻轻摇晃，弃除此部分显影液，后加入剩下的显影液。

12.摇晃至凝胶染色完全。

13.弃除显影液。

14 加入前面使用的 200 m L l X C a i r n s 』固定液至盒中，振 荡 5 min。

15.弃除固定液。

16.加人少许的软化水并振荡 2m i n。

17.用 C aims，保存液换掉软化水，振 荡 7 min。

18.胶放在玻璃板上（胶贴面朝下）。

1 9.在保存液中将大小合适的玻璃纸预湿，放在凝胶之上（见注释 14) 。

20.60°C 干燥凝胶过夜。

为了说明此方法用于复杂微生物群落在不同分类水平上具有的鉴定和比较价值，图2 和图 3 列举了在新鲜和风干的土壤中总的细菌和 BadZZzw 6enzoeworaws 相关群落的D G G E 图谱。