材料与仪器
牛舌
解聚缓冲液 组装缓冲液 匀浆缓冲液 抽提缓冲液 柱缓冲液 PEM 缓冲液
离心机
解聚缓冲液 组装缓冲液 匀浆缓冲液 抽提缓冲液 柱缓冲液 PEM 缓冲液
离心机
步骤
一、从牛舌上皮分离角蛋白中间丝
1. 从当地屠宰场拿到新鲜牛舌。一条舌头通常可以产出几十毫克纯化了的角蛋白中间丝。
2. 用刀片切刮，把舌中的肌肉和黏膜分开。舌黏膜片（大约 1cmx1 cm ) 于 4℃ 在含 20 mmol/L EDTA 和蛋白酶抑制剂的 PBS 中浸泡过夜。
3. 用镊子把表面的上皮从下面相连的组织中拉走。
4. 用解剖刀片把上皮切成小块，在解聚缓冲液（每克上皮用 25 ml ) 中于 20℃ 搅拌 2 小时。
解聚缓冲液：
50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0
8 mol/L 尿素
0.2% β-巯基乙醇
5. 制品于 20℃ 以 100000 g 离心 30 分度。
6. 用解聚缓冲液稀释上清使蛋白浓度为 0.5 mg/ml，在 4℃ 用组装缓冲液透析过夜。
组装缓冲液：
10 mmol/L Tris，pH 7.4
0.2% β-巯基乙醇
7. 透析了的制品在 4℃ 以 100000 g 离心 30 分钟，回收聚合了的角蛋白中间丝沉淀物。
8. 在解聚缓冲液中溶解沉淀并重复步骤 5~7。
9. 通过 SDS-PAGE 或用有广泛交叉反应的角蛋白抗体进行免疫印迹等检测方法来确定适当分子量蛋白质的富集程度。
二、从晶状体分离波形蛋白
1. 解剖从当地屠宰场得到的新鲜牛眼。解剖后，晶状体可以立即用于纯化波形蛋白，或如果需要，切下的晶状体可以在 -70℃ 冷冻几个月。
2. 每克组织 10 ml 匀浆缓冲液，在 4℃ 对晶状体进行匀浆。
匀浆缓冲液：
50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4
5 mmol/L MgCl2
0.1% β-巯基乙醇
3. 匀浆物在 4℃ 以 30000 g 离心 30 分钟。
4. 沉淀物用匀浆缓冲液洗 2 次，或一直洗到使上清变清。
5. 沉淀物于 4℃ 在抽提缓冲液中搅拌 4 小时。
抽提缓冲液：
50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4
8 mol/L 尿素
0.2% β-巯基乙醇
6. 20℃，100000 g 离心 30 分钟。
7. 每 100 ml 上清加 36 克硫铵，在 4℃ 搅拌 30 分钟。这可以使上清中的蛋白沉淀下来。
8. 20℃，25000 g 离心 20 分钟。
9. 沉淀物溶解在柱缓冲液中。在 20℃ 搅拌 1 小时。调 pH 到 7.2。
柱缓冲液：
8 mmol/L NaHPO4/Na2HPO4，pH 7.2
6 mol/L 尿素
140 mmol/L NaCl
1 mmol/L DTT
10. 20℃，100000 g 离心 30 分钟去掉不溶物。
11. 上清用经柱缓冲液平衡了的 Sephadex G-25 凝胶过滤脱盐。
12. 样品加到用柱缓冲液平衡的羟基磷灰石柱中。
13. 用 2 倍体积柱缓冲液洗柱子。
14. 用柱缓冲液，8~35 mmol/L 磷酸钠的线性梯度洗脱波形蛋白。
15. 用 SDS-PAGE 或免疫印迹确定含波形蛋白的收集液。
16. 把含波形蛋白的收集液混在一起，在 4℃ 用组装缓冲液进行透析。
17. 4℃，100000 g 离心 30 分钟回收得的波形蛋白中间丝。此外，波形蛋白中间丝可以在离心前先在液氮中冰冻并可以长期贮存在 -70℃。
三、从脊髓分离神经丝
1. 从当地屠宰场拿来新鲜的牛脊髓；它们必须立即浸在碎冰中。
2. 从脊髓解剖掉脑脊膜，脊髓在相同体积的 PEM 缓冲液中用匀浆机以最大速度在 4℃ 匀浆 5 分钟。
PEM 缓冲液：
100 mmol/L PIPES，pH 6.8
1 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgCl2
3. 4℃，28000 g 离心 50 分钟。
4. 上清中加甘油使甘油的终浓度为 20% (v/v)，在 37℃ 孵育 90 分钟。
5. 4℃，150000 g 离心 30 分钟。
6. 沉淀物在解聚缓冲液中溶解（蛋白浓度应该在大约 2.5 mg/ml）。
解聚缓冲液：
10 mmol/L 磷酸缓冲液，pH 7.5
6 mol/L 尿素
1 mmol/L EGTA
0.5 mmol/L DTT
7. 20000 g 离心 30 分钟去掉任何不溶物。
8. 上清加到用解聚缓冲液平衡的 DEAE 纤维素柱上。
9. 用 2 倍体积解聚缓冲液洗柱子。
10. 解聚缓冲液以 0~250 mmol/L 的 NaCl 梯度洗脱神经丝蛋白。
11. 通过 SDS-PAGE 和/或免疫印迹确定含 NF-L，NF-M，或 MF-H 的收集液。
12. 把感兴趣的收集液混在一起。
13. 使收集液浓度为 2 mg/ml，在 37℃ 用组装缓冲液透析 3 小时使蛋白聚合。
组装缓冲液：
100 mmol/L PIPES，pH 6.8
140 mmoI/L NaCl
1 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgCl2
14. 制品在 4℃ 以 200000 g 离心 60 分钟，回收聚合了的神经丝。
1. 从当地屠宰场拿到新鲜牛舌。一条舌头通常可以产出几十毫克纯化了的角蛋白中间丝。
2. 用刀片切刮，把舌中的肌肉和黏膜分开。舌黏膜片（大约 1cmx1 cm ) 于 4℃ 在含 20 mmol/L EDTA 和蛋白酶抑制剂的 PBS 中浸泡过夜。
3. 用镊子把表面的上皮从下面相连的组织中拉走。
4. 用解剖刀片把上皮切成小块，在解聚缓冲液（每克上皮用 25 ml ) 中于 20℃ 搅拌 2 小时。
解聚缓冲液：
50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0
8 mol/L 尿素
0.2% β-巯基乙醇
5. 制品于 20℃ 以 100000 g 离心 30 分度。
6. 用解聚缓冲液稀释上清使蛋白浓度为 0.5 mg/ml，在 4℃ 用组装缓冲液透析过夜。
组装缓冲液：
10 mmol/L Tris，pH 7.4
0.2% β-巯基乙醇
7. 透析了的制品在 4℃ 以 100000 g 离心 30 分钟，回收聚合了的角蛋白中间丝沉淀物。
8. 在解聚缓冲液中溶解沉淀并重复步骤 5~7。
9. 通过 SDS-PAGE 或用有广泛交叉反应的角蛋白抗体进行免疫印迹等检测方法来确定适当分子量蛋白质的富集程度。
二、从晶状体分离波形蛋白
1. 解剖从当地屠宰场得到的新鲜牛眼。解剖后，晶状体可以立即用于纯化波形蛋白，或如果需要，切下的晶状体可以在 -70℃ 冷冻几个月。
2. 每克组织 10 ml 匀浆缓冲液，在 4℃ 对晶状体进行匀浆。
匀浆缓冲液：
50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4
5 mmol/L MgCl2
0.1% β-巯基乙醇
3. 匀浆物在 4℃ 以 30000 g 离心 30 分钟。
4. 沉淀物用匀浆缓冲液洗 2 次，或一直洗到使上清变清。
5. 沉淀物于 4℃ 在抽提缓冲液中搅拌 4 小时。
抽提缓冲液：
50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4
8 mol/L 尿素
0.2% β-巯基乙醇
6. 20℃，100000 g 离心 30 分钟。
7. 每 100 ml 上清加 36 克硫铵，在 4℃ 搅拌 30 分钟。这可以使上清中的蛋白沉淀下来。
8. 20℃，25000 g 离心 20 分钟。
9. 沉淀物溶解在柱缓冲液中。在 20℃ 搅拌 1 小时。调 pH 到 7.2。
柱缓冲液：
8 mmol/L NaHPO4/Na2HPO4，pH 7.2
6 mol/L 尿素
140 mmol/L NaCl
1 mmol/L DTT
10. 20℃，100000 g 离心 30 分钟去掉不溶物。
11. 上清用经柱缓冲液平衡了的 Sephadex G-25 凝胶过滤脱盐。
12. 样品加到用柱缓冲液平衡的羟基磷灰石柱中。
13. 用 2 倍体积柱缓冲液洗柱子。
14. 用柱缓冲液，8~35 mmol/L 磷酸钠的线性梯度洗脱波形蛋白。
15. 用 SDS-PAGE 或免疫印迹确定含波形蛋白的收集液。
16. 把含波形蛋白的收集液混在一起，在 4℃ 用组装缓冲液进行透析。
17. 4℃，100000 g 离心 30 分钟回收得的波形蛋白中间丝。此外，波形蛋白中间丝可以在离心前先在液氮中冰冻并可以长期贮存在 -70℃。
三、从脊髓分离神经丝
1. 从当地屠宰场拿来新鲜的牛脊髓；它们必须立即浸在碎冰中。
2. 从脊髓解剖掉脑脊膜，脊髓在相同体积的 PEM 缓冲液中用匀浆机以最大速度在 4℃ 匀浆 5 分钟。
PEM 缓冲液：
100 mmol/L PIPES，pH 6.8
1 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgCl2
3. 4℃，28000 g 离心 50 分钟。
4. 上清中加甘油使甘油的终浓度为 20% (v/v)，在 37℃ 孵育 90 分钟。
5. 4℃，150000 g 离心 30 分钟。
6. 沉淀物在解聚缓冲液中溶解（蛋白浓度应该在大约 2.5 mg/ml）。
解聚缓冲液：
10 mmol/L 磷酸缓冲液，pH 7.5
6 mol/L 尿素
1 mmol/L EGTA
0.5 mmol/L DTT
7. 20000 g 离心 30 分钟去掉任何不溶物。
8. 上清加到用解聚缓冲液平衡的 DEAE 纤维素柱上。
9. 用 2 倍体积解聚缓冲液洗柱子。
10. 解聚缓冲液以 0~250 mmol/L 的 NaCl 梯度洗脱神经丝蛋白。
11. 通过 SDS-PAGE 和/或免疫印迹确定含 NF-L，NF-M，或 MF-H 的收集液。
12. 把感兴趣的收集液混在一起。
13. 使收集液浓度为 2 mg/ml，在 37℃ 用组装缓冲液透析 3 小时使蛋白聚合。
组装缓冲液：
100 mmol/L PIPES，pH 6.8
140 mmoI/L NaCl
1 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgCl2
14. 制品在 4℃ 以 200000 g 离心 60 分钟，回收聚合了的神经丝。
来源：丁香实验
