材料与仪器
脑组织
PME 缓冲液
匀浆器
PME 缓冲液
匀浆器
步骤
一、通过盐柚提从用紫杉醇稳定的微管中分离微管相关蛋白
1. 得到沉降下来的经紫杉醇稳定了的微管。或者可以通过加紫杉醇到 20 μmol/L 来稳定用组装/解聚方法制备的微管。
2. 于 37℃ 在微管中加 NaCl 使终浓度为 0.35 mol/L。
3. 37℃ 在溶液下面铺几毫升含 10% 蔗糖和 10 μmol/L 紫杉醇的 PME 缓冲液，立即在 25℃ 以 45000 g 离心 30 分钟。
4. 含 20 μmol/L 紫杉醇的 PME 缓冲液重悬微管，然后分装成小份（50 μl）在液氮中冷冻并贮存于 -80℃ 以备后用。
5. 通过透析或凝胶渗透层析给微管相关蛋白脱盐，然后如步骤 4 贮存。
二、用磷酸纤维素进行离子交换层析来纯化微管蛋白并去掉微管相关蛋白
准备磷酸纤维素柱
1. 磷酸纤维素悬浮在 0.5 mol/L KOH 或 NaOH 中，比例是每克磷酸纤维素用 15 ml 碱，至少 30 分钟，最多 2 小时。
2. 用 Buchmer 漏斗加上滤纸（Whatman # 1 ) 真空抽滤磷酸纤维素，用蒸馏水洗涤，直到流出液的 pH 值大于 8.0。
3. 拿洗瓶用水把沉降在漏斗上的磷酸纤维素冲下来，在 0.5 mol/L HCl（每克磷酸纤维素用 15 ml HCl）中轻轻地重悬磷酸纤维素，让磷酸纤维素沉降 30 分钟。
4. 去掉上清，用新鲜的 0.5 mol/L HCl ( 15 ml/g ) 轻轻地重悬磷酸纤维素，再沉降 30 分钟。
5. 用 Buchner 漏斗加上滤纸（Whatman#1）真空抽滤磷酸纤维素，用蒸馏水洗涤，直到流出液的 pH 值大于 5.0。
6. 拿洗瓶用水把沉降在漏斗上的磷酸纤维素冲下来，用柱缓冲液（CB ) 轻较地重悬磷酸纤维素。
柱缓冲液（CB )：
50 mmol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT( 或 DTE)
0.1 mmol/L GTP
7. 小心地用合适的碱滴定磷酸纤维素混和物使 pH 为 6.9，使用前贮存在 4℃。
8. 把磷酸纤维素混和物倒到适当大小（即 0.9 cm x 30cm ) 的柱子中，用柱缓冲液洗柱子，直到流出液的 pH 和离子强度和柱缓冲液的相同。
上样和跑柱子
9. 把组装/解聚的方法纯化得到的微管重悬在柱缓冲液中，在 4℃ 冷浴 30 分钟，然后离心使变澄清。
10. 每毫升柱床体积 1~3 mg 蛋白质的比例把含微管蛋白一聚体和微管相关蛋白的上清加到已平衡了的磷酸纤维素柱子上。
11. 用柱缓冲液以每分钟 0.5 ml 的速度洗柱子，以每管 1~2 ml 进行分部收集，在 280 nm 检测流出液的吸收值。
12. 在洗脱后，立即在含微管蛋白的收集液中加一定体积的浓缩贮存液，使 MgSO4 浓度为 1 mmol/L。
13. 管蛋白峰洗脱下来后，洗脱缓冲液改换成含 0.8 mol/L 盐的柱缓冲液（KCl 或 NaCl，取决于调节柱缓冲液中 PIPES 组分 pH 时所用的是哪种碱 )。
14. SDS-PACE 检测每个峰的纯度和组成。
1. 得到沉降下来的经紫杉醇稳定了的微管。或者可以通过加紫杉醇到 20 μmol/L 来稳定用组装/解聚方法制备的微管。
2. 于 37℃ 在微管中加 NaCl 使终浓度为 0.35 mol/L。
3. 37℃ 在溶液下面铺几毫升含 10% 蔗糖和 10 μmol/L 紫杉醇的 PME 缓冲液，立即在 25℃ 以 45000 g 离心 30 分钟。
4. 含 20 μmol/L 紫杉醇的 PME 缓冲液重悬微管，然后分装成小份（50 μl）在液氮中冷冻并贮存于 -80℃ 以备后用。
5. 通过透析或凝胶渗透层析给微管相关蛋白脱盐，然后如步骤 4 贮存。
二、用磷酸纤维素进行离子交换层析来纯化微管蛋白并去掉微管相关蛋白
准备磷酸纤维素柱
1. 磷酸纤维素悬浮在 0.5 mol/L KOH 或 NaOH 中，比例是每克磷酸纤维素用 15 ml 碱，至少 30 分钟，最多 2 小时。
2. 用 Buchmer 漏斗加上滤纸（Whatman # 1 ) 真空抽滤磷酸纤维素，用蒸馏水洗涤，直到流出液的 pH 值大于 8.0。
3. 拿洗瓶用水把沉降在漏斗上的磷酸纤维素冲下来，在 0.5 mol/L HCl（每克磷酸纤维素用 15 ml HCl）中轻轻地重悬磷酸纤维素，让磷酸纤维素沉降 30 分钟。
4. 去掉上清，用新鲜的 0.5 mol/L HCl ( 15 ml/g ) 轻轻地重悬磷酸纤维素，再沉降 30 分钟。
5. 用 Buchner 漏斗加上滤纸（Whatman#1）真空抽滤磷酸纤维素，用蒸馏水洗涤，直到流出液的 pH 值大于 5.0。
6. 拿洗瓶用水把沉降在漏斗上的磷酸纤维素冲下来，用柱缓冲液（CB ) 轻较地重悬磷酸纤维素。
柱缓冲液（CB )：
50 mmol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT( 或 DTE)
0.1 mmol/L GTP
7. 小心地用合适的碱滴定磷酸纤维素混和物使 pH 为 6.9，使用前贮存在 4℃。
8. 把磷酸纤维素混和物倒到适当大小（即 0.9 cm x 30cm ) 的柱子中，用柱缓冲液洗柱子，直到流出液的 pH 和离子强度和柱缓冲液的相同。
上样和跑柱子
9. 把组装/解聚的方法纯化得到的微管重悬在柱缓冲液中，在 4℃ 冷浴 30 分钟，然后离心使变澄清。
10. 每毫升柱床体积 1~3 mg 蛋白质的比例把含微管蛋白一聚体和微管相关蛋白的上清加到已平衡了的磷酸纤维素柱子上。
11. 用柱缓冲液以每分钟 0.5 ml 的速度洗柱子，以每管 1~2 ml 进行分部收集，在 280 nm 检测流出液的吸收值。
12. 在洗脱后，立即在含微管蛋白的收集液中加一定体积的浓缩贮存液，使 MgSO4 浓度为 1 mmol/L。
13. 管蛋白峰洗脱下来后，洗脱缓冲液改换成含 0.8 mol/L 盐的柱缓冲液（KCl 或 NaCl，取决于调节柱缓冲液中 PIPES 组分 pH 时所用的是哪种碱 )。
14. SDS-PACE 检测每个峰的纯度和组成。
来源：丁香实验
