材料与仪器
骨骼肌丙酮粉
肌动蛋白解聚缓冲液
超速离心机
肌动蛋白解聚缓冲液
超速离心机
步骤
1. 准备贮存液和材料
0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0
0.1 mol/L DTT（冻存在 -20℃，避免反复冻融）
0.1 mol/L CaCl2
0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0
肌动蛋白解聚缓冲液（惯称冷缓冲液 A)：
2 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0
0.2 mmol/L ATP
0.5 mmol/L DTT
0.2 mmol/L CaCl2
该缓冲液可以配制成不含 CaCl2 的 50x 贮存液并冻存（-20℃ )。
2. 10 g 肌肉丙酮粉（用上文方法制备）和 200 ml 缓冲液 A 混合并在 0℃ 搅拌抽提 30 分钟。
3. 不溶的碎片离心（SS-34 转头，16000 r/min，19950 g）10 分钟。
4. 保留上清，0℃ 下在 20 ml 缓冲液 A 里重新抽提沉淀物 10 分钟。
5. 再次离心（步骤 3 )；把两次离心得到的上清混在一起并测量体积。
6. 边在烧杯里搅拌，边加适量体积的贮存溶液使抽提物中含 50 mmol/L KCI，2 mmol/L MgCl2 和 1 mmol/L ATP。
7. 在 4℃ 聚合 2 小时。
8. 在冰库放 90 分钟。
9. 边搅拌边使 KCl 浓度达到 0.6~0.8 mol/L 以去除原肌球蛋白。
10. 在冰库里缓慢搅拌 30 分钟。
纯化肌动蛋白丝
11. 超速离心（50Ti 转头，35000 r/min，81000 g）3 小时以沉降丝状的肌动蛋白。
12. 去掉上清并用含 0.6 mol/L KCl 的缓冲液 A 轻轻地洗沉淀的表面。为了去掉夹杂在肌动蛋白沉淀中的污染物，沉淀物在含 0.6 mol/L KCl 的缓冲液 A 中进行匀浆。超速离心（50 Ti 转头，35000 r/min，81000 g）3 小时以再次沉降肌动蛋白。
13. 超速离心管中挖出沉淀物并放到一个玻璃匀浆器中。最大限度地把丝状肌动蛋白从管子转移到匀浆器中，接着（例如在转移了沉淀物后）在每个管子中加 1 ml 缓冲液 A 并孵育 1 小时。收集在缓冲液 A 中残余的肌动蛋白，加到匀浆器中，另外再加缓冲液 A 使加入的缓冲液 A 总体积为 30 ml。用带紧的研杵的 Dounce 牌匀浆器在缓冲液 A 中分散沉淀物，然后把匀浆物加到直径 1 cm 的透析管中。
14. 透析 1.5 天，换 3 次缓冲液 A。在充分搅拌的溶液中，KCI 透析一半的时间大约是 5 分钟，所以额外多换几次液会有帮助。对肌动蛋白丝进行机械破坏也会加速肌动蛋白丝的解聚。
15. 超速离心（50Ti 转头，35000 r/min，81000 g）3 小时使 G-肌动蛋白溶液变清。
16. 测量肌动蛋白浓度。
0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0
0.1 mol/L DTT（冻存在 -20℃，避免反复冻融）
0.1 mol/L CaCl2
0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0
肌动蛋白解聚缓冲液（惯称冷缓冲液 A)：
2 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0
0.2 mmol/L ATP
0.5 mmol/L DTT
0.2 mmol/L CaCl2
该缓冲液可以配制成不含 CaCl2 的 50x 贮存液并冻存（-20℃ )。
2. 10 g 肌肉丙酮粉（用上文方法制备）和 200 ml 缓冲液 A 混合并在 0℃ 搅拌抽提 30 分钟。
3. 不溶的碎片离心（SS-34 转头，16000 r/min，19950 g）10 分钟。
4. 保留上清，0℃ 下在 20 ml 缓冲液 A 里重新抽提沉淀物 10 分钟。
5. 再次离心（步骤 3 )；把两次离心得到的上清混在一起并测量体积。
6. 边在烧杯里搅拌，边加适量体积的贮存溶液使抽提物中含 50 mmol/L KCI，2 mmol/L MgCl2 和 1 mmol/L ATP。
7. 在 4℃ 聚合 2 小时。
8. 在冰库放 90 分钟。
9. 边搅拌边使 KCl 浓度达到 0.6~0.8 mol/L 以去除原肌球蛋白。
10. 在冰库里缓慢搅拌 30 分钟。
纯化肌动蛋白丝
11. 超速离心（50Ti 转头，35000 r/min，81000 g）3 小时以沉降丝状的肌动蛋白。
12. 去掉上清并用含 0.6 mol/L KCl 的缓冲液 A 轻轻地洗沉淀的表面。为了去掉夹杂在肌动蛋白沉淀中的污染物，沉淀物在含 0.6 mol/L KCl 的缓冲液 A 中进行匀浆。超速离心（50 Ti 转头，35000 r/min，81000 g）3 小时以再次沉降肌动蛋白。
13. 超速离心管中挖出沉淀物并放到一个玻璃匀浆器中。最大限度地把丝状肌动蛋白从管子转移到匀浆器中，接着（例如在转移了沉淀物后）在每个管子中加 1 ml 缓冲液 A 并孵育 1 小时。收集在缓冲液 A 中残余的肌动蛋白，加到匀浆器中，另外再加缓冲液 A 使加入的缓冲液 A 总体积为 30 ml。用带紧的研杵的 Dounce 牌匀浆器在缓冲液 A 中分散沉淀物，然后把匀浆物加到直径 1 cm 的透析管中。
14. 透析 1.5 天，换 3 次缓冲液 A。在充分搅拌的溶液中，KCI 透析一半的时间大约是 5 分钟，所以额外多换几次液会有帮助。对肌动蛋白丝进行机械破坏也会加速肌动蛋白丝的解聚。
15. 超速离心（50Ti 转头，35000 r/min，81000 g）3 小时使 G-肌动蛋白溶液变清。
16. 测量肌动蛋白浓度。
来源：丁香实验
