材料与仪器
预杂交液 SSC SDS
硝酸纤维素滤膜
硝酸纤维素滤膜
步骤
1. 准备适合即将进行的工作的杂交溶液。每平方厘米硝酸纤维素滤膜或尼龙膜大约需要 0.2 ml 预杂交液。
预杂交液：
用于检测低丰度序列：
或者
6x SSC ( 或 6x SSPE)
5 x Denhardt 试剂
0.5% SDS
100 μg/ml 经变性并被打断的鲑精 DNA
或者
6x SSC ( 或 6x SSPE)
5 x Denhardt 试剂
0.5% SDS
100 μg/ml 经变性并被打断的鲑精 DNA
50% 甲酸胺
2. 含靶 DNA 的硝酸纤维素滤膜或尼龙膜浮在盛 6x SSC ( 或 6x SSPE) 的托盘表面，直到完全湿透。滤膜浸 2 分钟。
3. 把湿的滤膜滑入一个可热封口的袋子（例如 Sears 的 Seal-A-Meal 牌或同类产品）。每平方厘米硝酸纤维素滤膜或尼龙膜加 0.2 ml 预杂交液。
从袋子中挤出尽可能多的空气。用热封口机封住袋子的开口端。袋子在合适的温度（水溶剂用 68℃；含甲酰胺的溶剂用 42℃）孵育 1~2 小时。
4. 如果放射性标记的探针是双链的，要在 100℃ 加热变性 5 分钟。单链探针不需要变性。在冰水上快速冷却探针。
5. 迅速把装有滤膜的袋子从水浴中取出。用剪刀剪下袋子的一个角。在预杂交液中加变性的探针，然后从袋子中挤出尽可能多的空气。用热封口机再次封住袋子使留在袋子中的空气尽可能的少。为了避免放射性物质污染水池，再次封口的袋子应该封到第二个没有污染的袋子中去。
用于尼龙膜的杂交液：
6x SSC ( 或 6x SSPE )
0.5% SDS
100 μg/ml 经变性并被打断的鲑精 DNA
50% 甲酰胺（如果在 42℃ 进行杂交）
6. 把袋子浸入设定为合适温度的水浴池，按所需的时间进行杂交反应。
7. 戴手套，从水池拿出袋子并立即剪掉一个角。杂交液倒到一个适于处理的容器中，然后剪开袋子的三个边。拿出滤膜并立即浸入一个放在室温下的盛几百毫升 2x SSC 和 0.5% SDS 的托盘中。
8. 在 5 分钟后，把滤膜转移到一个盛几百毫升新鲜 2x SSC 和 0.5% SDS 的托盘中并在室温孵育 15 分钟，不经常地轻轻搅动。
9. 滤膜转移到一个平底的盛几百毫升新鲜 0.1x SSC 和 0.5% SDS 的塑料盒子中。滤膜在 37℃ 孵育 30 分钟到 1 小时，轻轻搅动。
10. 用新鲜 0.1x SSC 和 0.5% SDS 换溶液，并把盒子转移到一个设定为 68℃ 的水浴池中放同样长的时间。用一个手持小检测器检测滤膜上放射活性的量。滤膜上不含 DNA 的部分不应该发出可检测到的信号。对于含有杂交/单拷贝探针的哺乳动物 DNA 的滤膜，你不应该指望能在小检测器上测到信号。
11. 室温下用 0.1x SSC 短时间地洗一下滤膜。把滤膜放在一堆纸巾上以去掉大多数液体。
12. 把潮湿的滤膜放到一片塑料膜上。在塑料膜的几个不对称的位置涂上带黏性的有放射活性的墨水作点标记。这些标记是用于校正自显影图像和滤膜的位置。用透明胶带盖住标记。这是为了防止放射活性墨水污染胶片夹或增感屏。
13. 用第二张塑料膜盖住滤膜，让滤膜对 X-射线胶片（Kodak XAR-2 或同类产品）曝光来获得放射自显影图像。曝光时间应该通过经验决定。但是在使用增感屏的情况下，哺乳动物基因组 DNA 中的单拷贝序列通常可以在 -70℃ 曝光 16~24 小时以后检测到。
预杂交液：
用于检测低丰度序列：
或者
6x SSC ( 或 6x SSPE)
5 x Denhardt 试剂
0.5% SDS
100 μg/ml 经变性并被打断的鲑精 DNA
或者
6x SSC ( 或 6x SSPE)
5 x Denhardt 试剂
0.5% SDS
100 μg/ml 经变性并被打断的鲑精 DNA
50% 甲酸胺
2. 含靶 DNA 的硝酸纤维素滤膜或尼龙膜浮在盛 6x SSC ( 或 6x SSPE) 的托盘表面，直到完全湿透。滤膜浸 2 分钟。
3. 把湿的滤膜滑入一个可热封口的袋子（例如 Sears 的 Seal-A-Meal 牌或同类产品）。每平方厘米硝酸纤维素滤膜或尼龙膜加 0.2 ml 预杂交液。
从袋子中挤出尽可能多的空气。用热封口机封住袋子的开口端。袋子在合适的温度（水溶剂用 68℃；含甲酰胺的溶剂用 42℃）孵育 1~2 小时。
4. 如果放射性标记的探针是双链的，要在 100℃ 加热变性 5 分钟。单链探针不需要变性。在冰水上快速冷却探针。
5. 迅速把装有滤膜的袋子从水浴中取出。用剪刀剪下袋子的一个角。在预杂交液中加变性的探针，然后从袋子中挤出尽可能多的空气。用热封口机再次封住袋子使留在袋子中的空气尽可能的少。为了避免放射性物质污染水池，再次封口的袋子应该封到第二个没有污染的袋子中去。
用于尼龙膜的杂交液：
6x SSC ( 或 6x SSPE )
0.5% SDS
100 μg/ml 经变性并被打断的鲑精 DNA
50% 甲酰胺（如果在 42℃ 进行杂交）
6. 把袋子浸入设定为合适温度的水浴池，按所需的时间进行杂交反应。
7. 戴手套，从水池拿出袋子并立即剪掉一个角。杂交液倒到一个适于处理的容器中，然后剪开袋子的三个边。拿出滤膜并立即浸入一个放在室温下的盛几百毫升 2x SSC 和 0.5% SDS 的托盘中。
8. 在 5 分钟后，把滤膜转移到一个盛几百毫升新鲜 2x SSC 和 0.5% SDS 的托盘中并在室温孵育 15 分钟，不经常地轻轻搅动。
9. 滤膜转移到一个平底的盛几百毫升新鲜 0.1x SSC 和 0.5% SDS 的塑料盒子中。滤膜在 37℃ 孵育 30 分钟到 1 小时，轻轻搅动。
10. 用新鲜 0.1x SSC 和 0.5% SDS 换溶液，并把盒子转移到一个设定为 68℃ 的水浴池中放同样长的时间。用一个手持小检测器检测滤膜上放射活性的量。滤膜上不含 DNA 的部分不应该发出可检测到的信号。对于含有杂交/单拷贝探针的哺乳动物 DNA 的滤膜，你不应该指望能在小检测器上测到信号。
11. 室温下用 0.1x SSC 短时间地洗一下滤膜。把滤膜放在一堆纸巾上以去掉大多数液体。
12. 把潮湿的滤膜放到一片塑料膜上。在塑料膜的几个不对称的位置涂上带黏性的有放射活性的墨水作点标记。这些标记是用于校正自显影图像和滤膜的位置。用透明胶带盖住标记。这是为了防止放射活性墨水污染胶片夹或增感屏。
13. 用第二张塑料膜盖住滤膜，让滤膜对 X-射线胶片（Kodak XAR-2 或同类产品）曝光来获得放射自显影图像。曝光时间应该通过经验决定。但是在使用增感屏的情况下，哺乳动物基因组 DNA 中的单拷贝序列通常可以在 -70℃ 曝光 16~24 小时以后检测到。
来源：丁香实验
