非放射性标记的核酸探针

 

第四节　非放射性标记的核酸探针

放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。

酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。

化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA或RNA分子上。

非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下：

一、生物素标记核酸探针方法

生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。

缺口平移法标记生物素DNA探针：在硅化Eppendorf管（放入冰浴中）加下列反应液：

待标记DNA 0.1μg/μl 　　　　　　5μl

10×NTB　　　　　　　　　　　　　1μl

DNase I 2pg/μl 　　　　 　　　　1μl

消毒三蒸水 　　　　　　　　　　　3μl 总体积达10μl

混匀，37℃，15min。离心10000r/min 1min后，放入冰浴中，继续加入下列反应液：

dNTP(ACG)0.5μg/ml　　　　　　　　2μl

Bio �11 �dUTP 0.5μg/ml　　　　2μl

10×NTb　　　　　　　　　　　　　4μl

消毒三蒸水　　　　　　　　　　　31μl

混匀，短暂离心后，加入

DNA聚合酶I（5u/μl）1μl　　　　总体积50μl

混匀，14℃过夜（10h以上），加入

终止液 2μl

经Sephadex �G �50柱分离，回收生物素标记DNA。

　　10×NTB配法：500mmol/l Tris �HCl, Ph7.5；100mol/L MgCl ₂ ；80mmol/L β-巯基乙醇，500μg/ml BSA。

终止液：0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA和10mmol/l Tris �HCl (pH7.5)。

　　缺口平移法标记探针少量多次标记效果较好，即每次标记DNA不超过1μ.Bio �11-dUTP要浓贮，分装，-20 ^。 C保存，反复冻融常会降解失活。Bio �11- dUTP贮存液：10mmol/L即100μg Bio-11-dUTP中加入11.6μl Bio-11 �dUTP稀释液，分装成3μl/支，-20℃保存。

地高辛-dUTP标记DNA也可按此法进行。

　　乙醇沉淀分离回收标记DNA比较方便，即加入5μl4mmol/l LiCl,125μl冷乙醇，混匀，-20℃放置30min,12000r/min离心5min，去上清，用70%乙醇和无水乙醇洗沉淀物，倒置 离心管 ，晾干，用消毒三蒸水5μl溶解沉淀物（0.1μg/μl）-20 ^。 C保存。用LiCl 可较好地分离DNA和可溶性核苷酸，因为dNTPS的锂盐在乙醇中比钠盐溶解性更大。

二、光敏生物素标记核酸探针

　　光敏生物素有一个连接臂，一端连接生物素，另一端有芳基叠氮化合物。在可见光照射下，芳基叠氮化合物可能变成活化芳基硝基苯，很易与DNA或RNA的腺嘌呤N―7位置特异结合，大约每50个碱基结合一个生物素，所以只用于标记大于200个核苷酸的片段。光敏生物素的醋酸盐很易溶于水，与核酸形成的共价结合很稳定。此法有以下优点：方法简便易行，快速省时，不需昂贵的酶和dUTP等；只需光照，探针稳定，-20℃可保存12个月以上。适用于DNA和RNA，抗体和酶等的标记。在原位分子杂交，斑点杂交和Southern印迹杂交中应用，其特异性和灵敏性较高，价廉易购，国内已有 试剂 盒供应，军事医学科学院放射医学研究所马立人教授等研制和生产的光敏生物素核酸探针和检测试剂盒使用良好。

方法步骤：在一灭菌Eppendorf管中加待标记DNa 5μg/10μl，在暗室中加入5μg/5μl光敏生物素，充分混匀，插入冰浴中，置特制光源下10cm处照射20min。加入100mmol/l Tris �HCl pH9.0, 1.0mmol/L EDTA 10μl混匀。再加入等体积仲丁醇，混匀。离心1min（10000r/min）吸去上层仲丁醇，弃去。再加入仲丁醇25μl，重复提取游离的光敏生物素。吸去上层无色仲丁醇后，加入5μl 3mol/L醋酸钠，充分混匀，加入冷无水酒精100μl充分混匀，沉淀标记DNA，置-20℃过夜（或-70℃15min）15000r/min离心20min，沉淀物再用70%乙醇洗一次，离心，抽干，溶于0.1mmol/l EDTA或TE中，测定探针浓度，分装，保存于-20℃。

三、生物素-补骨脂素（Biotin -psoralen）标记法

生物素-补骨脂素是另一种生物素光敏物质，在长波长紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应，加成到DNA中，去除小分子后，得到生物素标记核酸探针。此法可标记单链或双链DNA或RNA，及寡核苷酸。灵敏度与放射性探针相当。标记方法：取DNA或片段0.5μg加50μlTE（pH8.0）缓冲液中，再加入5μlg生物素-补骨脂素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射20min，距离5cm，加等体积TE，移入用TE平衡的Sephadex G―50 柱（高1.0cm），离心法过柱，收集液体即为Bio �DNA探针。

四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法

此法是在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基，使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA探针。此法优点是采用通用试剂和技术，检出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰，此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。在合适的条件下，可有3%～4%的碱基被修饰。新鲜配制亚硫酸氢钠-乙二胺混合液，两者混合液含量分别为1mol/L和3mol/l （pH6.0），加入对苯二酚，使终浓度为1mg/ml。将DNA用超声打成500～800bp长度的片段，煮沸法变性，取1份DNA与9份上述混合液混合，42℃水浴3.5h。用5mmol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5）在40℃下充分透析，浓缩DNA，再溶于200μl 0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5），再加入4mmol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂，室温反应2h，用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）在40℃下充分透析，纯化，-20℃保存。

五、缺口平移法标记生物素DNA探针（二步法）

取HBV质粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水补足体积至10μl，37℃，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio �11- dUTP各2μl，10×NBt 4μl，三蒸水补足体积至10μl,37℃，15min；三蒸水补足体积至49μl，DNA聚合酶i 5u，混匀，14℃过夜，加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl终止反应。

已标记探针的提纯：10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris �HCl (pH7.5) 150μl,2.5倍体积的95%乙醇，置液氮中15min或-20℃过夜。15000r/min，离心10min，真空干燥后，溶于适量三蒸水中，即为纯化的探针，-20℃备用。

　　使用闭环或线性双链质粒DNA，或分离的双链DNA片段均可进行此法标记，全质粒标记敏感性较高，因为标记物可同时掺入 载体 DNA。

此法也可用于放射性同位素和地辛标记DNA法。

六、生物素随机引物标记探针方法

以HBV DNA为例。取HBv DNA质粒0.5μg，随机引物（Pharmacia）2μg，用TE（pH8.0）补足体积至10μl；100℃，热变性5min