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    基本方案 非放射性蛋白质截短试验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    患者和正常人的保存于乙醇中的 RNA 或 DNA 样品
    乙酸钠 随机引物 反转录试剂盒 二硫苏糖醇 4dNTP 混合液 RNase 抑制剂 特异性的 PCR 引物 RNase H 10 X PCR 缓冲液 Taq 酶 丙烯酰胺 双丙烯酰胺 SDS Tris • Cl 过硫酸铵 运行缓冲液 电转缓冲液（冰预冷） 甲醇 Tris 盐缓冲液 10 X 顺丁烯二酸贮存液 POD 偶联链霉亲和素 洗脱缓冲液 抗 HA 高亲和力抗体 过氧化物酶偶联兔抗鼠免疫球蛋白
    非放射性蛋白质截短试验试剂盒 PVDF Western blotting 膜 化学发光底物试剂盒 灭菌巴氏德管 Perkin Elmer 2400、9600 或 9700 PCR 仪 SDS-PAGE 系统 塑料托盘 Whatman 3MM 滤纸 保鲜膜

    步骤

    1.取 1〜 3哗乙醇中保存的R N A ，加 0.1倍体积的3m ol/L乙酸钠(pH5. 6),12 OOOg 4°C 离 心 lOmin。 2. 用灭菌巴氏德管吸掉上层液体，空气中干燥，注意不要太干。 3a. 随机引物扩增:在上述R N A 中加2M1 0. 随机引物和8. 5 4 水(或两者事先的 混合物10. 5 4 也可） ，混合后，65°C 孵 育 IOmin后立即置冰上。 3 b .特异性引物(GSP)扩增:在空气干燥的R N A 中加人8. 5 4 水 和 24 lOpmol/^l 的反 向引物，混合，在 65° C 孵 育 IOmin后立即冰浴。 4•加入下列成分至总体积2〇4: 反转录酶缓冲液 0. l m o l / L D T T 2^1; 10mmol/L 4d N T P 2^1； 40U /jli1RNasin 0. 5/^1； 5〇 U /)lx1反转录酶 I.Ojml。 30°C 孵育 10min，42°C 孵育 60min。 5.可选:准备R N A 引物，加 入 4U RNase H 37 Cf浮育20m i n 用于第二链扩增(产物可储 存于一20°〇。 6. 准 备 25W 第一轮P C R 混合液1: 10mmol/L 4 dNTPljul； 第 5 步 的 c D N A 2〜知I; 基因特异性正向引物20pmol;
    基因特异性反向引物20pm〇 l; 加水至25卩1。 7 . 准备25jul下述混合液2: 10X P C R 缓冲液5^; Tag 酶 0.5〜2U ; 加水至25卩 1。 8. 加 25|ul混合液2 至混合液1，按下述参数进行第一轮P C R 扩增（Perkin Elmer 2400、 9600 或 9700 P C R 仪） ： 起始步骤 2min 94〇C 25〜30个循环 15s 93〇C 30s 55〜60°C lmin/kb 72°C 最终步骤 7min 72〇C 将 P C R 产物储存于4°C-。 9 . 准 备 2 5 M 1 第二轮扩增混合液1: 10XPCR 缓冲液 T 叫 酶 0.5〜2U ; 加水至2 5 4 。 10. 准 备 25p J第二轮PCR混合液2: 1 0 m m o l / L 4 d N T P lj^ l； 加尾内部前向引物2 0 〜 3 0 p m o l ; 内部反向引物2 0 〜 3 0 p m o l ; 1 0 X 稀释或未稀释第一轮P C R 产 物 2 5 0 〜 3 0 0 n g D N A I jlJ ; 加水至25/lJ 。 1 1 . 应用第 8 步的参数进行第二轮P C R 扩增。 1 2 . 琼脂糖凝胶电泳分析P C R 产物。注意任何片段大小的异常可能意味着:遗传重排或 突变影响到R N A 剪切，或 R T - P C R 过程中被基因组D N A 污染。 1 3 •将下述成分加到0. 5 m l P C R 管中： 50〜500ngPCR 产物 I jljJ ; 4X T 7 转录混合物1.25^; 水 2. 75^1。 3 0 °C 孵育 1 5 m i n 。 I4. 可选:将2. 5/al转录混合物进行1 % 琼脂糖凝胶电泳，分析其转录效率。如果在PCR 产物下有一条清晰可见的R N A 条带则意味着是成功的。 15•将2. 5M 1转录混合物(第13步)和IOmI 翻译混合物(生物素标记的赖氨酸） ，3(TC孵育 60min，储存于一20°C 。 16. 用水和乙醇清洁玻璃板和Spacers，在制胶格中安装两个胶盒(附录3F 的 Mini Protea n ll制胶系统） 。 17. 准备下述混合液用于制备两份1〇%的胶：
    30%( m /V )37. 5 : 1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺3. 3ml(可根据产物大小调节浓度) ； I.5mol/L Tris • Cl，p H 8. 8 2. 5m l ; 水 4m l ; 10% SDS IOOjLtl; A P S lOOjul； T E M E D 4^10 加 18. 将上述混合液倒入准备好的两玻璃板之间，液面距小玻璃板上缘2. 5c m ，小心将7jC 至胶液上，使两者之间形成一平整的液面。 60m i n 后胶凝固。 19. 准备下述混合液用于制备两份堆积胶： 30%(m /V )37. 5 : 1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺67〇4; lmol/L Tris • Cl,p H 6. 8, 500^1； 水 2. 7m l ; 10% SDS 40^1; A P S 40^1； T E M E D 4^1〇 20. 将玻璃板间的水去除，小心加入堆积胶混合液，小心插入梳子，注意不要留有气泡。 等 待 15min，让胶凝固。 21. 移走梳子，用水冲洗加样孔，将胶板安装到电泳槽上，加上电泳缓冲液。 22. 将 2^x1翻译产物和124 SDS上样缓冲液混合，点离，P C R 仪 上 95°C变 性 4min。 23. 上样:包括样品、对照及Makers。 24. 70V 电泳 15〜30min。 25. 再将电压加至120V 电泳1〜I.5h 。 26. 分开玻璃板，取出胶，去掉堆积胶，将剩余胶置于冰预冷的电转缓冲液5min。 27. 用甲醇冲洗P V D F Western blotting膜 lmin，用电转缓冲液冲洗5min。 28. 将胶从缓冲液中拿出，去除多余的液体。将一 7c m X I O c m 的 W h a t m a n 滤纸盖在胶 上 ，轻压滤纸，赶走滤纸与胶之间的气泡。 29. 将电转缓冲液至塑料托盘中，将电转盒放在塑料托盘内，用电转缓冲液浸湿纤维垫 和其他相关膜或垫，按下列步骤进行安装(注意不要留有气泡） ： 纤维垫； 两张 7c m X IOcm 的 Whatman 3M M 滤纸； 胶(倒置安装） ； 电转膜； 一张 What m a n 3M M 滤纸； 纤维垫。 3〇.将电转盒关紧并插入电转固定架内。将一冰盘放在装满电转缓冲液的缸中。 31. 120V 、250m A 电转 lh。 32. 将膜取下，用 T B S 洗膜
    化学焚光检测 33a. 将膜置于25ml I X 顺丁烯二酸溶液中或2 % 的封闭剂中封闭，室温下40min或 4°C 过夜。 34a. 加 5^x1POD偶联链霉亲和素至封闭液中，温和摇动室温下孵育30min。 35a•准备5m l 检测溶液，g卩 5m l 发光底物和50m r 溶液B 混合，用前室温下避光保存。 36a. 用 50m l 洗涤缓冲液洗膜4 次 ，每 次 lOmin。 37a. 将光敏感底物溶液倒入一塑料托盘内，将膜浸入到溶液中，温和摇动lmin。 38a. 用保鲜膜将膜包起来，避免气泡。 3 % . 将膜在X 线底片上曝光或用荧光探测器检测转录产物的特征。 H A 标签的检测 33b. 将膜置于25ml T B S 溶液中或1% 的封闭剂中封闭，室温下I h 或 4°C 过夜。 34b. 将封闭液减至15ml，加 0. 2哗/1111的抗H A 抗体，温和摇动室温下孵育lh。 35b. 用 50m l洗涤缓冲液洗膜3 次 ，每次5min。 36b. 加 1. 3哗/ m l 抗 Ig过氧化物酶偶联抗体，室温下孵育3〇 min。 37b. 用 50n d 洗涤缓冲液洗膜3 次，每次5min。 38b. 将膜置于检测缓冲液(第37a 步)孵育lmin。 39b. 用保鲜膜将膜包起来，避免气泡。将膜在X 线底片上曝光或用荧光探测器检测转录 产物的特征。 支 持 方 案 R N A 的分离与分析 小心:硫氰酸胍具有刺激性，酚具有毒性，处理和使用时要小心。 注意:所有的R N A 样品须在冰上操作。 材料(标V 的条目参见附录1): 用 EDTA-包被的血液收集管(Greiner公司） 收集的患者血标本或在75cm2组织培养 皿上培养的8 0 % 〜9 0 % 汇合度的细胞 Histopague~1077(Sigma 公司） V P B S ，pH7. 8,灭菌后4°C保存 放线菌酮(可选;Sigma公司） 含硫氰酸胍和酚的R NAzolBCCampro Scientific公司） 氯仿 异丙醇 7 0 % 乙醇，4°C 100% 乙醇，4°C T 10Ea^l 冲液，pH8. 0:10mmol/L Tris • 〇/〇 •lmmol/L EDTA，pH8. 0 lmol/L NaOH SeaKem琼脂糖(FM C产品）
    灭菌I X T B E 缓冲液 V 10m g /ml溴化乙键 V 3mol/L 乙酸钠(用乙酸将p H 调至5.6) V 甲酰胺上样缓冲液 R N A 大小和质量marker 12m l 白盖试管 Beckman GS-6R水平转头微离心机 灭菌细胞刮片 CEP 口腔刮板(Life Technologies 公司） 从患者血液中抽提RNA la. 用 E D T A -包被的血液收集管收集IOml患者血标本。 2a.各加5ml Histopague-1077至 2 个 12m l 的白盖离心管中，小心在Histopague-1077上 力口5m l 血液，950g 室温下水平转子离心20min(不用刹车，让转子自然停下） 。 3a.弃最上层(血清和血小板） ，将第二层（ 白色层） 即淋巴细胞层转移至IOml试管中，用 4°C 灭菌P B S 洗涤，550g• 、室温下水平转子离心lOmin。 4a.小心倒掉上清，轻轻拍打试管使剩下的液体重悬白色(有时候是红色)沉淀，冰浴，接下 面第5 步。 从培养的细胞中抽提RNA lb. 可选:收获前，将细胞培养于含lOOjug/m l 放线菌酮的培养基中4〜8h。 小 心 ：放 线 菌 酮 有 毒 ，须 在 通 风 橱 中 配 制 。 2b.当 75cm2组织培养皿上细胞长至8 0 % 〜9 0 % 汇合度时，倒去培养基，小心用4°C 灭菌 PBS洗涤细胞。 3b•加5ml PBS，将培养皿置于冰上，用灭菌的细胞刮板刮取细胞，将细胞转移至一新的 12m l白盖试管中，再加5ml P B S 至细胞培养皿再次刮取细胞。收集所有细胞。 4b.550g•室温下水平转子离心lOmin。小心倒掉上清，冰浴，接下面第5 步。 从口腔细胞中抽提RNA lc. 要求患者用水漱口清洗口腔几次清除食物残渣(如咖啡或其他食物等)。 2c.用灭菌CEP 口腔刮板刮取口腔两侧黏膜收集细胞。 3c.将 CEP 口腔刮板置于Spin-Ease提取管中，轻微离心。将刮板及管子一起置于一新的 I.5m l 试管中，立即加1〜I.3ml R N A zoIB至刮板，孵育5min。 4c.12 OOOg离心lmin，接下面第6 步。 5. 加 I.2ml R N A z o I B 至沉淀（ 每 5m l 血 液 或 75cm2组织培养皿的细胞加1 〜I.3m l RNAzolB)。用 Tip吹打细胞几次使其裂解，将裂解液转移至一 i.5〜2.Oml的微离心 管中。 6. 每 I.Oml裂解液加0. Iml氯仿，剧烈振摇15s，冰浴5min。 7.12 OOOg 4°C离心 15min〇
    8. 小心转移上层清亮水相(〇. 6〜0. 7ml)至一新的微离心管中，加 1 倍体积的异丙醇，冰 浴 15min(如果需要可储存于4°C 〜20°C )。 9. 12 000茗 4°C离心 15min。 10•弃上清，用 200jul 70% 乙醇洗涤R N A 沉淀。 11. 12 OOOg 4°C离 心 lOmin，小心弃上清，空气干燥(不要太干） 。 12. 用 50jlJ ^ 以 溶 解 沉 淀 ，加12〇4 100 % 乙醇后一80°C保存。 13. 小心清洗琼脂糖电泳槽，注意去除RNase的活性，用 lmol/L NaOH浸 泡 lh ，再用灭 菌水冲洗。 M.用灭菌IX T B E 缓冲液制备I .5 % ( m/V )SeaKem琼脂糖，其 中加l 〇 mg/m l溴化乙锭 至 O Jpg/m l终浓度。 15. 取相当于储存样品的5 % 〜1 0 % ，加 3mol/L 乙酸钠（ p H 5. 6)至终浓度为0 •3mol/L ， 12 OOOg 4°C离心 lOmin。 16. 小心弃上清，用 5/^1甲酰胺上样缓冲液溶解沉淀，将样品加至上样孔中，词时加R N A - marker0 17. 电泳。用手提便携式U V (紫外线） 观察仪观察，对 照 RNA-marker•估计R N A 的浓 度、质量(如18S 和 23S rRN A条带清晰可见） 和有无D N A污染(在胶的上方有大的 条带)。 备选方案使用偶联转录/翻译法进行放射蛋白质截短实验 在体外，一个管中进行的偶联转录/翻译实验相对于非偶联方法来说要显得简单些 (但控制更加困难） 。使用该方法，作者成功地翻译出160kDa的蛋白质产物(来源于一 4k b 的序列） ，但是，该方法翻译出的副产物(背景产物)也相应显著地增加了。 材料(标V 的 条 目 参 见 附 录 1): TnT T7-家兔网织红细胞体外转录/翻译偶联系统(Promega公司） ： TnT 17 R N A 聚合酶 T n T 家兔网织红细胞裂解物 T n T 反应缓冲液 L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐的混合物 含萤光素酶报告基因的质粒 萤光素酶 萤光素酶分析试剂 5mCi/ml[3H ] 标记的凭氣酸(]_60Ci/mmol; Amersham 公 司 ） I.5U/^tl RNase 抑制剂（ 如 RNasin ;Promega 公司） 灭菌水 " 2 X SD S样品缓冲液 分 子 marker:14C 标记(Amersham公司） 的或预染的(Bio-Rad公司） 蛋白质marker "染 色 液 二甲基亚砜（ dimethylsulfoxide， D M S O )
    0 1 ^ 0 ^ 50(1111〇1/乙2,5-二苯嗯唑溶解于〇“ 5 0 中 ，可反复使用 2或 3次 ） ，或其 他放射自显影增强试剂(如Arnersham公司的Amplify、M E N Life Science公司 的 E N 3H A N C E ) 塑料盒 Whatman 3M M 滤纸 干胶仪 X-Omat AR 胶片（Eastman Kodak 公司） 1. 准备c D N A (从患者R N A 反转录后经过两轮扩增的P C R 产物） 或扩增的D N A 样品 (基本方案，第 1〜12步)。 _2._将 T n T T 7-家兔网织红细胞体外转录/翻译偶联系统从一70°C冰箱中取出，放置于冰 上 ，将 T n T T 7 R N A 聚合酶直接置于冰上，等融解后将所有其他成分都置于冰上。用 手握法快速融解转录/翻译偶联系统。 不要将TnT T 7 R N A 聚合酶放在冰上太长时间，反应系统准备好后尽可能快地将 系统再次冻存。 3. 在一 L 5m l 的微离心管准备转录/翻译系统，同时用试剂盒的中荧光素酶质粒准备一 个对照： 家兔网织红细胞体外转录/翻译偶联系统12. 5“ ； T n T 反应缓冲液IjuJ; T n T T 7 R N A 聚合酶 〇. 氨基酸混合物0. 54; 5mCi/ml[3H ]标记的亮氨酸2^ x1; 40U //m1RNasin 0. 5jul； PCR 产物 50〜500ng; 加灭菌水至25/jJ。 混合后在30°C 孵育60min(在25〜37°C 不会太影响翻译效率） 。 在一个12pl反应体系中将P C R 产物与T n T 混合系统的比例控制在1 : 2 以下同 样可以得到好的结果。 4. 在转录/翻译产物中加1 倍体积的2X S D S 样品缓冲液混合，储存于一70°C 。 5. 准备SDS^P A G E 胶，用根据翻译产物的大小选择适当的蛋白质marker，对反应产物进 行电泳(基本方案，第 16〜27步） 。 6. 电泳完后将胶转移至一塑料盒内，覆盖染色液，温和摇动孵育15〜30m in 。 如果使用14C 标记的蛋白质marker，染色步驟可以省略。 7. 弃染色液，用脱色液反复冲洗胶块，直到蛋白质marker清晰可见。 8. 用水冲洗胶块15min。 9. 用 D M S O 覆盖胶块温和摇动IOmin,使胶块脱水。重复脱水一次。 小心：D M S O 具有化学危险性，第 8〜10步中须在通风橱中进行。 10. 将胶置于D M S O /P P O 中孵育lOmin，共 2 次。 11. 用水冲洗胶块10〜15min直到胶变白。 12. 将胶放在Whatman 3M M 滤纸上，在干胶仪上干燥(60〜7(TC I h 以上）
    13.用 X-Omat A R 胶片进行放射自显影(见CPM B附 录 3A )，在放射自显影图上检测翻 译产物的特征，如果使用萤光素酶对照，则可在图上寻找62k D a 的蛋白质条带。 通常情况下，在一个12jul反应体系中翻译50ng I.5k b 的 P C R 产物经过过夜(8h 以上)曝光后很容易在放射自显影图上检测到。

    来源：丁香实验

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