从人肝脏或胎盘组织中分离核仁

组织
NKM
粗孔滤纸 Teflon-玻璃匀浆器

1. 准备溶液：

NKM：0.13 mol/L NaCl，5 mmol/L KCl，8 mmol/L 乙酸镁

2.2 mol/L 蔗糖，10 mmol/L MgCl₂

0.88 mol/L 蔗糖

0.34 mol/L 蔗糖，含 0.5 mmol/L MgCl₂ 或 0.5 mmol/L 乙酸镁

2. 用大约 200 g 组织，切成小块（2~4 cm² ) 通过一搅肉机。

3. 用 NKM 悬浮搅碎的组织；最终体积大约为 850~900 ml。在一 500 ml 的离心管中 4500 g 离心 10 分钟。用 NKM 溶液洗两次。

4. 称取洗过的沉淀的重量，悬浮于 100 ml 含 2.2 mol/L 蔗糖，10 mmol/L MgCl₂ 或乙酸镁的溶液中。用带紧密结合 Teflon 研棒，马达推动的 Potter-Elvehjem 匀浆器匀浆 10~12 次。

5. 将匀浆用含 Mg²⁺ 的 2.2 mol/L 蔗糖溶液稀释至肝脏沉淀重量的 10 倍。

6. 先后用一层和两层粗孔滤纸过滤匀浆。

7. 过滤后的匀浆 20000 g 离心 2 小时。

8. 用一干净的刮刀刮下沉淀。用一紧密结合 Tefflon-玻璃匀浆器匀浆使之溶于含 5 mmol/L Mg2+ 的 0.88 mol/L 蔗糖溶液中。2500 g 离心 20 分钟。

9. 从细胞核沉淀中分离细胞核或核仁。

(1) 分离细胞核

① 沉淀重悬浮于含 5 mmoI/L Mg²⁺ 的 0.34 mol/L 蔗糖溶液中。

② 下面加一层 0.88 mol/L 蔗糖溶液（无 Mg²⁺）。

③ 2500 g 离心 20 分钟。

(2) 制备核仁

① 将第 8 步中得到的沉淀以每克组织 0.3 ml 的体积重悬浮于含 5 mmol/L Mg²⁺ 的 0.34 mol/L 蔗糖溶液中。

② 用一冰水冷却的菊花状振荡头进行超声处理。

③ 每 10 秒钟超声处理后进行 10 到 20 秒的冷却间隔，监测细胞核的破碎情况。

10. 超声处理物从振荡头中取出放进一 50 ml 的塑料离心管中。

11. 75 g 离心 4 分钟澄清超声处理物。

12. 取出上清放到干净的离心管中。

13. 下面加一层无 Mg²⁺ 的 0.88 mol/L 蔗糖溶液，2500 g 离心 20 分钟。

14. 吸出上清。