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蛋白质及标志酶的分析

相关实验:过氧化物酶体的分离和分析实验

最新修订时间:

材料与仪器

NaF MgCl2 BSA 棕榈酰辅酶A 氯仿-甲醇 液闪试剂
离心机

步骤

1. 准备分析试剂:



缓冲液:可以采用 Tris-HCl(0.3 moI/L,pH7.5)或 MES(0.3 mol/L,pH 5.7)。

0.1 mol/L NaF

0.1 mol/L MgCl2

脂肪酸含量低的 BSA ( ICN) -20 mg/ml H2O

2. 向一只 16 mm x 125 mm 的螺口管中按顺序加入下列试剂:

缓冲液                   0.15 ml

BSA                       0.05 ml

棕榈酰辅酶A         0.05 ml

NaF                       0.05 ml

MgCl2                    0.05 ml

DHA12P                 0.05 ml

用于分析的收集物(0~0.1 mg 蛋白质)

加 H2O 至 0.6 ml 的体积

3. 将反应在 37℃ 保温 15 分钟。

4. 加入 2.25 ml 氯仿-甲醇(1:2)并混合均匀使反应终止。

5. 加入 0.75 ml 的氯仿和 0.75 ml 的 KCl-H3PO4(2~0.2 mol/L),振荡,在桌面离心机上离心 5 分钟(500~1000 g)。

6. 吸出上层并加入 2.5 ml 的 CH3Cl-甲醇-H2O (1:12:12) 及 0.1 ml ( 2 滴)的 6 mol/L H3PO4 洗涤下层两次,振荡并离心使之分层。

7. 将等份的洗涤后的下层液(一般为 1 ml,即总体积的 2/3)转至计数瓶中,在通风橱中加热并吹入空气使瓶内的溶剂蒸发。

8. 向干燥的残余物中加入液闪试剂,混合后使之溶解,在液闪计数器上确定放射性。

来源:丁香实验

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