材料与仪器
细胞
PEG3350
YPAD 液体培养基 涡旋振荡器
PEG3350
YPAD 液体培养基 涡旋振荡器
步骤
1. 将菌株接种 100 ml 的 YPAD 液体培养基，30℃ 振荡培养过夜，使细胞滴度达到每毫升 1X108 到 2X108 个细胞。
2. 3000 g 离心 5 分钟沉淀细胞，用 100 ml 灭菌水洗两遍，加 200 μl 灭菌水重悬细胞沉淀。
3. 加 100 μl 细胞悬液到 50 μl 含有 100~150 ng 需转化的 DNA 和 20 μg 单链载体 DNA 的溶液中，充分混匀。
4. 加 200 μl 50% 的 PEG3350，用涡旋振荡器快速混匀。
5. 将混合物置于 42℃ 水浴孵育 15 分钟。
6. 将混合物转移到冰冷的 0.2 cm BioRad 电穿孔杯中，用带有脉冲控制器或其他相应设备的 BioRad 基因脉冲器进行电穿孔，条件：1.5 kV、25 μFD、200 Ω。
7. 立即加入 600 μl 冰冷的 YPAD 培养基或灭菌蒸馏水，转移到一个灭菌的 1.5 ml 微量离心管中，冰浴 5 分钟。
8. 离心 2 秒沉淀细胞，用室温的 YPAD 培养基或灭菌蒸馏水洗一遍，重悬于 1 ml 的 YPAD 或灭菌蒸馏水。
9. 取 2、20、200 μl 涂布 SC 减样选择培养基平板，30℃ 培养 3~4 天。
2. 3000 g 离心 5 分钟沉淀细胞，用 100 ml 灭菌水洗两遍，加 200 μl 灭菌水重悬细胞沉淀。
3. 加 100 μl 细胞悬液到 50 μl 含有 100~150 ng 需转化的 DNA 和 20 μg 单链载体 DNA 的溶液中，充分混匀。
4. 加 200 μl 50% 的 PEG3350，用涡旋振荡器快速混匀。
5. 将混合物置于 42℃ 水浴孵育 15 分钟。
6. 将混合物转移到冰冷的 0.2 cm BioRad 电穿孔杯中，用带有脉冲控制器或其他相应设备的 BioRad 基因脉冲器进行电穿孔，条件：1.5 kV、25 μFD、200 Ω。
7. 立即加入 600 μl 冰冷的 YPAD 培养基或灭菌蒸馏水，转移到一个灭菌的 1.5 ml 微量离心管中，冰浴 5 分钟。
8. 离心 2 秒沉淀细胞，用室温的 YPAD 培养基或灭菌蒸馏水洗一遍，重悬于 1 ml 的 YPAD 或灭菌蒸馏水。
9. 取 2、20、200 μl 涂布 SC 减样选择培养基平板，30℃ 培养 3~4 天。
来源：丁香实验
