原理
检测支原体有两种不同的策略：第一种方法将在下述方案中述及，利用对 DNA 染色的荧光染料 Hoechst 33258, 它对细胞核周围（在细胞表面或胞质中）的特殊物质进行染色，可显示支原体污染；第二种方法是利用 DNA 探针识别细胞提取物中的 DNA 支原体特异序列，进行支原体污染的检测。对这个方案，照试剂供应商（fisher Scientific) 的说明进行。
材料与仪器
步骤
1) 准备下列液体，然后除菌并冷藏。
无酚红的 HBSS
NaCl 8 g
KCl 0.4 g
CaCl2 0.14 g
MgSO4•7 H2O 0.1g
MgCl2•6 H2O 0.1g
Na 2 HPO4•2 H2O 0 .06 g
KH 2 PO4 0.06 g
葡萄糖 1.0 g
NaHCO3 0.35 g
dH2O 1000 ml
Hoechst 1000x 贮存液
柠檬酸/磷酸盐缓冲液（2X)
0.1mol/L 柠檬酸 22.2 ml
0.2mol/LNa 2 HPO4 2 7.8 ml
用柠檬酸或 Na 2 HPO4 调节 pH 为 5.5。
2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化细胞于培养皿中的 Labtek 玻片上或盖玻片。
3) 加人 1~2 ml 培养液覆盖表面，让细胞生长 2~3 天。
4) 准备 Camoy 固定液（应在每次用前制备新鲜的)。
Camoy 固定液
3 份甲醇
1 份冰乙酸
5) 吸干培养液，不用洗涂单层细胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室内或培养皿中。培养皿中充满 Camoy 固定液（约 5 ml）室温中放置平皿 2 分钟。
6) 去除培养皿中液体，加人新鲜固定液以充满室内或培养皿中（约 5 ml)。室温中放置平皿 5 分钟。
7) 重复歩骤 6。
8) 去除固定液，去除 Labtek 室的塑料外套或将培养皿的玻片拿出，让细胞在室温中晾干 30 分钟或更长。
9) 用 Hoechst1000x 储存液（步骤 1) 配制 Hoechst 工作液。
Hoechst 工作液
工作液宜每次新鲜配制
用 10ml HBSS 稀释 0.1 ml Hoechst 储存液（0.5ug/ml)
用 5 ml HESS 稀释 0.5 ml Hoechst 储存液（0.05ug/ml)
或
用 50 mlHBSS 稀释 50ul Hoechst1000x 储存液；每 Coplin 染缸中加人 40 ml。
10) 室温条件下，在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液（终浓度为 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分钟。
11) 用 dH2O 漂洗两次。
12) 等体积混和甘油、梓檬酸/磷酸缓冲液（在步骤 1 中制备），制备封闭培养液以覆盖住细胞。
13) 在玻片和盖玻片之间加入 2 滴封闭培养液，用纸巾轻轻吸出多余液体。
14) 用橡胶黏合剂封闭玻片和盖玻片。
15) 用荧光显微镜观察标本。应用激发波长为 330/380nm 和光栅过滤器 LP440nm。
无酚红的 HBSS
NaCl 8 g
KCl 0.4 g
CaCl2 0.14 g
MgSO4•7 H2O 0.1g
MgCl2•6 H2O 0.1g
Na 2 HPO4•2 H2O 0 .06 g
KH 2 PO4 0.06 g
葡萄糖 1.0 g
NaHCO3 0.35 g
dH2O 1000 ml
Hoechst 1000x 贮存液
柠檬酸/磷酸盐缓冲液（2X)
0.1mol/L 柠檬酸 22.2 ml
0.2mol/LNa 2 HPO4 2 7.8 ml
用柠檬酸或 Na 2 HPO4 调节 pH 为 5.5。
2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化细胞于培养皿中的 Labtek 玻片上或盖玻片。
3) 加人 1~2 ml 培养液覆盖表面，让细胞生长 2~3 天。
4) 准备 Camoy 固定液（应在每次用前制备新鲜的)。
Camoy 固定液
3 份甲醇
1 份冰乙酸
5) 吸干培养液，不用洗涂单层细胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室内或培养皿中。培养皿中充满 Camoy 固定液（约 5 ml）室温中放置平皿 2 分钟。
6) 去除培养皿中液体，加人新鲜固定液以充满室内或培养皿中（约 5 ml)。室温中放置平皿 5 分钟。
7) 重复歩骤 6。
8) 去除固定液，去除 Labtek 室的塑料外套或将培养皿的玻片拿出，让细胞在室温中晾干 30 分钟或更长。
9) 用 Hoechst1000x 储存液（步骤 1) 配制 Hoechst 工作液。
Hoechst 工作液
工作液宜每次新鲜配制
用 10ml HBSS 稀释 0.1 ml Hoechst 储存液（0.5ug/ml)
用 5 ml HESS 稀释 0.5 ml Hoechst 储存液（0.05ug/ml)
或
用 50 mlHBSS 稀释 50ul Hoechst1000x 储存液；每 Coplin 染缸中加人 40 ml。
10) 室温条件下，在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液（终浓度为 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分钟。
11) 用 dH2O 漂洗两次。
12) 等体积混和甘油、梓檬酸/磷酸缓冲液（在步骤 1 中制备），制备封闭培养液以覆盖住细胞。
13) 在玻片和盖玻片之间加入 2 滴封闭培养液，用纸巾轻轻吸出多余液体。
14) 用橡胶黏合剂封闭玻片和盖玻片。
15) 用荧光显微镜观察标本。应用激发波长为 330/380nm 和光栅过滤器 LP440nm。
来源：丁香实验
