反转录合成单链 cDNA 实验

RNA RT主体混合液
薄壁PCR管 离心管 热循环仪

一、材料

1.核酸和寡核苷酸

来自方案2的RNA

为每个单独的H-T₁₁M引物，分别配制RT主体混合液

蒸馏水                                28.2ul

5XRT缓冲液                       12.0ul

2.5mmol/LdNTP混合液        4.8ul

H-T₁₁M(原文为H-T₁M。一译者改）

引物（这里M=G、A或C)6.0ul

2.专用设备

0.5ml离心管

0.2ml薄壁PCR管（GenHunterT101)

热循环仪[推荐使用GeneAmpPCRSystem9600(Perkin-ElmerCorporation,Norwalk，CT)或者Mastercycler(EppendorfScientific，Westbury，NY)]

3.附加试剂

RNAspectraFluorescentmRNA差异显示系统（GenHunterF501-F510R501-R510)，包括蒸馏水、5XRT缓冲液[125mmol/LTris-HCl、pH8.3，188mmol/LKCl,7.5mmol/LMgCl₂,25mmol/L二硫苏糖醇（DTT)]、FDDdNTP混合液(2.5mmol/L)、锚定引物（H-T11M)(2umol/U以及MMLV逆转录酶（100U/ul)

二、方法

cDNA合成

1.按照下面步骤，配制3个反应管（为3种H-T₁₁M引物各准备一个）。
各取42.5ulRT主体混合液，加到标记好的、无RNA酶的0.2ml薄壁PCR管中。记住要为所用的每个锚定引物（H-T₁₁M)准备单独的RT反应！

2.用DEPC处理过的H20,将RNA稀释到终浓度并充分混匀，置于冰上。

3.取5.0ul稀释的RNA(0.1ug/ul),加到0.5ml管子中，并充分混匀。

4.按照下面程序设置热循环仪：65°C 5min→37°C 60min→75°C 5min →4°C平衡。

5.将反应管放到热循环仪中，开始程序。

6.当反应进行到37°C10min时，暂停热循环仪，在每个管中加入2.5ulMMLV逆转录酶，迅速混匀后继续温育。

7.反转录结束后，最高转速短暂离心，收集冷凝水。

8.将反应管放在冰上或-20°C备用。