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以磁性顆粒为基础纯化 PCR 产物实验

相关实验:以磁性顆粒为基础纯化 PCR 产物实验

最新修订时间:

材料与仪器

乙醇 PCR 样品
自动定位器 吸头 液体处理自动机械 分离装置 平板密封条 PCR 纯化系统

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

乙醇,80%

2. 核酸和寡核苷酸

在 96 孔板中的 PCR 样品(不多于100ul/孔)

3. 特殊设备

3 台单位置的实验用自动定位器(BeckmanCoulter)

4 套 P250 盒装吸头(BeckmanCoulter)

4X4 位置实验用自动定位器(BeckmanCoulter)

96 孔吸头洗涤自动实验用定位器(BeckmanCoulter)

加热和冷却自动实验用定位器(BeckmanCoulter)

液体处理自动机械,如 BiomekFx 或 Biomek2000 实验室自动工作平台(BeckmanCoulter)

MagnaBot96 磁性分离装置(Promega)

无浸透性的平板密封条

回旋振荡式自动实验用定位器(BeckmanCoulter)

吸头装卸自动实验用定位器(BeckmanCoulter)

平板夹 96(Promega)

4. 其他

WizardMagneSilPCR 纯化系统 [Promega; 包括 MagneSilYellow(顺磁性顆粒)、洗涤液、无核酸酶的水和收集板]

二、方法

下述方案中的步骤和时间安排是为在开发机器人自动处理的过程中使用 MagneSilPCR纯化系统而提供的,该步骤以及所用试剂的体积也可以用于手工处理过程中。该体系适用于从 100ul 样品中纯化 PCR 产物。

1.DNA 的结合

(1) 从储存于 96 孔板中的 PCR 样品开始,用无核酸酶的水将各样品的体积调整至 100ul。

(2) 振荡 MagneSil 颗粒使之充分重悬,然后将其向每孔中分别加入 100ul。

(3) 上下抽吸 4 次以混合孔内的物质。

(4) 室温下溫育 2 min, 温育 lmin 后上下抽吸 4 次进行混合。

(5) 将已混合的样品转移到 96 孔收集板内,将板置于 MagnaBot96 磁性分离装置上以顆粒磁化。

(6) 移弃上清液。

2. 洗涤

(1) 从 MagnaBot96 磁性分离装置上取出含顺磁性顆粒的收集板,然后向每个孔中加200ul 洗涤液。

(2) 上下抽吸 4 次以混合孔内物质。

(3) 将收集板置于 MagnaBot96 磁性分离装置上以使顆粒磁化。

(4) 移弃上清液。

(5) 从 MagnaBot96 磁性分离装置上取出收集板,向孔内加入 200ul80% 的乙醇。

(6) 上下抽吸 4 次以混合孔内物质。

(7) 将收集板置于 MagnaBm96 磁性分离装置上以使颗粒磁化。

(8) 移弃上清液。

(9) 用 200ul80% 的乙酵重复步骧 (5)~(8),使乙醇洗涤次数达到 2 次。

(10) 将板留在 MagnaBot96 磁性分离装置上干燥 5?10 min, 从孔中吸去所有残留乙醇。

3.DNA 的洗脱

(1) 从 MagnaBot96 磁性分离装置上取出板,加入 lOOul 无核酸酶的水以从顺磁性顆粒上洗脱 PCR 产物,上下抽吸 4 次以混合孔内物质,室温下温育 2 min。

(2) 将收集板豎于 MagnaBot96 磁性分离装置上以使颗粒磁化。

(3) 将洗脱的 PCR 产物转移到干净的收集板中。

(4) 如洗出液仍携带有顆粒,将收集板放置于 MagnaBot96 磁性分离装置上并将洗出液转移到干净的收集板中,或者也可以在从收集板中转移样品时将收集板放置在 MagnaBot96磁性分离装置上。

(5) 用无浸透性的平板密封条将板紧封,4°C 储存 1?2 天或-2°C 长期储存。

来源:丁香实验

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