原理
将细胞接种在皮氏培养皿中的盖玻片上，放入 5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中培养。
材料与仪器
碳酸氢钠缓冲的Ham’s F10培养液
低渗溶液 0.8%胰蛋白酶
带有开孔盖的35mm塑料皮氏培养皿 盖玻片 手术镊
低渗溶液 0.8%胰蛋白酶
带有开孔盖的35mm塑料皮氏培养皿 盖玻片 手术镊
步骤
准备和细胞培养
1. 在两个常规容器中将样本离心（150 g，10 min )。如果仅用 1 个常规容器收集样本，在离心前将样本分到另 1 个常规容器中，以免离心时由于破裂引起样本丢失的危险。
2. 将灭菌的盖玻片放入 2 个皮氏培养皿中，用样本名称标记盖和皿。
3. 用吸管吸去上清液，在细胞上面保留 1 ml 液体。
4. 混悬细胞，将细胞悬液移入皮氏培养皿。
5. 每个皿加入 3 ml 培养液，在 38°C、5% CO2 和湿润的培养箱中培养。
6. 5~7 天后用倒置显微镜观察细胞的生长状况。
7. 部分更换培养液，即用无菌巴斯德吸管吸去 2 ml 培养液，再加入等量的新鲜培养液。
8. 每周检査和换液两次。当大小适中和生长良好的克隆达到足够数量时，准备收集细胞。收集细胞通常在开始培养后 10~14 天进行。
原位盖玻片收集法
9. 在采集前，将盖玻片移入含有培养液的新皮氏培养皿（作适当标记），放置 24 h 。应保留原培养皿，作为多余细胞的储备来源。
10. 将 0.3 ml 稀释的秋水仙酰胺加入皮氏培养皿中，使终浓度为 0.1 μg/ml。培养 2~3 h。
11. 用巴斯德吸管轻轻吸去培养液，然后加入 3 ml 预温至 37°C 的 0.05 mol/L KCl 低渗溶液（0.05 mol/L KCl， 用超纯水配制），培养 10 min。
12. 将皮氏皿从培养箱中取出，放在合适的实验盘上。将标记的皿盖放在皿的下面。
13. 贴皮氏皿的边轻轻加入 6 滴固定液，使固定液扩散入低渗溶液，固定 1 min。
14. 再向皮氏皿中加入 6 滴固定液，固定 1 min。
15. 从皮氏皿中吸去 2 ml 上清液后，贴皮氏皿的边轻轻加入 2 ml 新鲜固定液，固定 2 min。
16. 从皮氏皿中吸去全部上清液，贴皮氏皿的边轻轻加入 3 ml 新鲜固定液，固定 10 min。
17. 吸去全部固定液后，使盖玻片在培养皿中晾干。吸去固定液后，将盘的一边抬高，促使残留的固定液从盖玻片上流掉。
用胰蛋白酶进行 G 带显带
18. 在 60°C 烤箱中过夜或在 75°C 热盘上 2 h，使盖玻片老化。为了便于识别，将盖玻片放入皮氏培养皿中。
19. 用生理盐水配制 0.04 % 胰蛋白酶（用于显带，用生理盐水配制（将 0.4 ml 已配制的 Difco 胰蛋白酶加入 50 ml 生理盐水中），在显带前立即将 1 份 Leishman 染液与 4 份 pH 6.8 缓冲液混合。
20. 用镊子将盖玻片放在胰蛋白酶溶液中，轻轻晃动几秒钟。应根据盖玻片老化程度改变胰蛋白酶处理时间。
21. 用缓冲液将盖玻片浸洗后，放回皮氏培养皿。
22. 立即将稀释的 Leishman 染液注入皮氏培养皿，根据染料的实际作用染色 2~4 min。
23. 用缓冲液浸洗盖玻片冲洗后，将其放在吸纸上，并靠在皮氏培养皿上，使盖玻片上的液体引流掉，让其晾干。
24. 在封片前检査盖玻片的显带质量。
25. 用 DPX 将盖玻片封同于已标记的载玻片上。
1. 在两个常规容器中将样本离心（150 g，10 min )。如果仅用 1 个常规容器收集样本，在离心前将样本分到另 1 个常规容器中，以免离心时由于破裂引起样本丢失的危险。
2. 将灭菌的盖玻片放入 2 个皮氏培养皿中，用样本名称标记盖和皿。
3. 用吸管吸去上清液，在细胞上面保留 1 ml 液体。
4. 混悬细胞，将细胞悬液移入皮氏培养皿。
5. 每个皿加入 3 ml 培养液，在 38°C、5% CO2 和湿润的培养箱中培养。
6. 5~7 天后用倒置显微镜观察细胞的生长状况。
7. 部分更换培养液，即用无菌巴斯德吸管吸去 2 ml 培养液，再加入等量的新鲜培养液。
8. 每周检査和换液两次。当大小适中和生长良好的克隆达到足够数量时，准备收集细胞。收集细胞通常在开始培养后 10~14 天进行。
原位盖玻片收集法
9. 在采集前，将盖玻片移入含有培养液的新皮氏培养皿（作适当标记），放置 24 h 。应保留原培养皿，作为多余细胞的储备来源。
10. 将 0.3 ml 稀释的秋水仙酰胺加入皮氏培养皿中，使终浓度为 0.1 μg/ml。培养 2~3 h。
11. 用巴斯德吸管轻轻吸去培养液，然后加入 3 ml 预温至 37°C 的 0.05 mol/L KCl 低渗溶液（0.05 mol/L KCl， 用超纯水配制），培养 10 min。
12. 将皮氏皿从培养箱中取出，放在合适的实验盘上。将标记的皿盖放在皿的下面。
13. 贴皮氏皿的边轻轻加入 6 滴固定液，使固定液扩散入低渗溶液，固定 1 min。
14. 再向皮氏皿中加入 6 滴固定液，固定 1 min。
15. 从皮氏皿中吸去 2 ml 上清液后，贴皮氏皿的边轻轻加入 2 ml 新鲜固定液，固定 2 min。
16. 从皮氏皿中吸去全部上清液，贴皮氏皿的边轻轻加入 3 ml 新鲜固定液，固定 10 min。
17. 吸去全部固定液后，使盖玻片在培养皿中晾干。吸去固定液后，将盘的一边抬高，促使残留的固定液从盖玻片上流掉。
用胰蛋白酶进行 G 带显带
18. 在 60°C 烤箱中过夜或在 75°C 热盘上 2 h，使盖玻片老化。为了便于识别，将盖玻片放入皮氏培养皿中。
19. 用生理盐水配制 0.04 % 胰蛋白酶（用于显带，用生理盐水配制（将 0.4 ml 已配制的 Difco 胰蛋白酶加入 50 ml 生理盐水中），在显带前立即将 1 份 Leishman 染液与 4 份 pH 6.8 缓冲液混合。
20. 用镊子将盖玻片放在胰蛋白酶溶液中，轻轻晃动几秒钟。应根据盖玻片老化程度改变胰蛋白酶处理时间。
21. 用缓冲液将盖玻片浸洗后，放回皮氏培养皿。
22. 立即将稀释的 Leishman 染液注入皮氏培养皿，根据染料的实际作用染色 2~4 min。
23. 用缓冲液浸洗盖玻片冲洗后，将其放在吸纸上，并靠在皮氏培养皿上，使盖玻片上的液体引流掉，让其晾干。
24. 在封片前检査盖玻片的显带质量。
25. 用 DPX 将盖玻片封同于已标记的载玻片上。
来源：丁香实验
