方案23.11 前列腺上皮

取出前列腺和处理标本（30 min），用胶原蛋白酶消化前列腺组织（1 h），收集单个细胞和小的细胞团（1 h）。接种细胞，培养至形成单层（7 d）。

胎牛血清或马血清 青霉素 卡那霉素 霍乱毒索 地塞米松 EGF 羊催乳激素或鼠催乳激素 胰岛素 部分精制的前列腺调理素或精制的前列腺调理素 I型胶原蛋白酶 大鼠
生长培养液 盐性培养液
Petri培养皿 手术剪 注射器和14-G插管 25ml Erlenmeyer烧瓶 金属丝滤网 50ml锥形塑料离心管 尼龙滤网 24孔塑料培养板 振荡水浴箱 离心机 血细胞计数板或Coulter计数器

1. 在无菌条件下，取出理想的前列腺叶，放入灭菌过的 60 mm Petri 培养皿（玻璃或塑料的，直径为 60 mm）。

2. 剪除前列腺叶的脂肪，然后称重。

3. 加入 2 ml 胶原蛋白酶（675 U/ml，用含有 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 卡那霉素的 MSS 配制）。

4. 用手术剪将前列腺叶剪成约 1 mm 大小的组织块。组织块应小，足够通过 14-G 插管。

5. 用注射器和 14-G 插管将组织块移于灭菌过的 25 ml Erlenmeyer 烧瓶，然后加入胶原蛋白酶，每 0.1 g 湿组织加入 1 ml。

6. 置于振荡水浴箱，在 37°C 条件下孵育 1 h 。

7. 分 3 次用 14-G 插管吸出消化的细胞悬液，然后用孔径为 1 mm 的金属丝滤网（孔径为1 mm，与 50 ml 锥形离心管配用）将细胞悬液滤入 50 ml 圆锥形塑料离心管，以除去碎片和未消化的组织。加入等量含有 5 % 胎牛血清或马血清的 MSS，浸洗细胞悬液。

8. 在 4°C 条件下离心（100 g，5 min），收集细胞。

9. 用 5 ml 含有 5 % 血清的 MSS 混悬细胞，然后依次用孔径为 250 μm 、150 μm、100 μm 和 40 μm 的尼龙滤网（与 50 ml 锥形离心管配用）过滤细胞悬液，并每次用 5 ml 含有 5 % 血清的 MSS 冲洗滤网。

10. 通过离心收集细胞，然后用 5 ml WAJC404 培养液混悬细胞。

11. 计数细胞，将细胞浓度调整至 4×10⁶ 个/ml。

12. 将细胞接种于 24 孔板，每孔（面积约为 2 cm²）接种 50 μl 细胞悬液（含有 2×10⁵ 个细胞）。每孔内有 1 ml WAJC404 培养液、10 ng/ml 霍乱毒素、1 μmol/L 地塞米松、10 ng/ml EGF、1 μg/ml 催乳激素、5 μg/ml 胰岛素、10 ng/ml 前列腺调理素、100 U/m 青霉素和 100 μg/ml 链霉素。可按 McKeehan 等 [1984] 以及 Chaproniere 和 McKeehan [1986] 叙述的方法替代部分精制的前列腺调理素。

13. 在 95 % 空气和 5 % CO₂ 的湿润环境和 37°C 条件下培养。第 3 天和第 5 天换液。第 7 天细胞可能接近单层。