原理
用随机引物延伸法标记 M13mp9 DNA [ Finberg and Voglstein，1983 ]，并用葡聚糖柱（Sephadex） 纯化。
材料与仪器
模板 HEPES DTM试剂 氧核苷酸 牛血清蛋白 P-dGTP Klenow 酶
DTM试剂 OL试剂 标记缓冲液 洗柱缓冲液
Sephadex 柱
DTM试剂 OL试剂 标记缓冲液 洗柱缓冲液
Sephadex 柱
步骤
1. 在无菌小管中，将 2 μl 稀释的 M 13 DNA （0.25 ng/μl Boehringer Mannheim，以 1:4 稀释于蒸馏水中）和 11 μl 蒸馏水混匀。
2. 将小管置于沸水浴 2 min。
3. 直接将小管放入冰中 5 min。
4. 在小管中加入 11. 4 μl LS 缓冲液（标记缓冲液，LS 缓冲液，1 mol/L 的 HEPES：DTM ：OL 为 100: 100:28）和 0.5 μl 的 BSA。（HEPES，1 mol/L，pH 6.6；DTM 试剂：dATP、dCTP 和 dTTP，每种各 100 μmol/L 溶解于 250 mmol/L的 Tris-HCl，25 mmol/L 的 MgCl2 及 50 mmol/L 的 2-巯基乙醇（pH 8.0）中；OL 试剂：在 1 mmol/L Tris 和 1 mmol/L EDTA中含有 90 O.D 单位的寡聚脱氧核苷酸（PH 7.5））
5. 在 Perspex 屏后面，向小管中加入 10 μl 32P-dGTP（3 Ci/mmol， Amersham international plc） 和 2 μl Klenow 酶（1 μg/μl，测序级，Life Technologies）。
6. 小管内容物混匀后短暂离心。
7. 在 Perspex 屏后，室温下孵育试管。
8. 用移液管小心地将小管中的液体移到预先用 10 ml 洗柱缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl， pH 7. 5，1 mmol/L EDTA）平衡的 Sephadex 柱（如 NICK 柱， Amersham Pharmacia）中。
9. 用洗柱缓冲液 400 μl 洗 2 次，收集第 2 次 400 μl 的洗出液作为纯化的探针。
10. 煮沸纯化探针 2 min 后，置于冰上冷却，再与杂交液混合。
2. 将小管置于沸水浴 2 min。
3. 直接将小管放入冰中 5 min。
4. 在小管中加入 11. 4 μl LS 缓冲液（标记缓冲液，LS 缓冲液，1 mol/L 的 HEPES：DTM ：OL 为 100: 100:28）和 0.5 μl 的 BSA。（HEPES，1 mol/L，pH 6.6；DTM 试剂：dATP、dCTP 和 dTTP，每种各 100 μmol/L 溶解于 250 mmol/L的 Tris-HCl，25 mmol/L 的 MgCl2 及 50 mmol/L 的 2-巯基乙醇（pH 8.0）中；OL 试剂：在 1 mmol/L Tris 和 1 mmol/L EDTA中含有 90 O.D 单位的寡聚脱氧核苷酸（PH 7.5））
5. 在 Perspex 屏后面，向小管中加入 10 μl 32P-dGTP（3 Ci/mmol， Amersham international plc） 和 2 μl Klenow 酶（1 μg/μl，测序级，Life Technologies）。
6. 小管内容物混匀后短暂离心。
7. 在 Perspex 屏后，室温下孵育试管。
8. 用移液管小心地将小管中的液体移到预先用 10 ml 洗柱缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl， pH 7. 5，1 mmol/L EDTA）平衡的 Sephadex 柱（如 NICK 柱， Amersham Pharmacia）中。
9. 用洗柱缓冲液 400 μl 洗 2 次，收集第 2 次 400 μl 的洗出液作为纯化的探针。
10. 煮沸纯化探针 2 min 后，置于冰上冷却，再与杂交液混合。
注意事项
1. 2-巯基乙醇可挥发且有毒性。
2. 32P 产生高能量的 β 粒子，应尽量减少暴露，操作要戴手套，使用 1 cm 厚的 Perspex 屏。
3. 由于柱内残留未结合的核苷酸， 所以仍有很高的放射性。
4. 涉及放射性物质的操作，应该按照国家和当地条例进行操作，开展这样的工作之前要向当地生物安全部门咨询。
2. 32P 产生高能量的 β 粒子，应尽量减少暴露，操作要戴手套，使用 1 cm 厚的 Perspex 屏。
3. 由于柱内残留未结合的核苷酸， 所以仍有很高的放射性。
4. 涉及放射性物质的操作，应该按照国家和当地条例进行操作，开展这样的工作之前要向当地生物安全部门咨询。
来源：丁香实验
