原理
将细胞依次置于浓度逐渐增加的叶酸拮抗剂中，如氨甲蝶呤（MTX ) 中，经过一段时间，细胞会产生对药物毒性的抵抗 [ Biedler et al ，1972 ]，这是 DHFR 基因扩增的结果，这种抗性通常产生得非常快，当然可能还有其他机制部分或全部参与到抗性表型的形成中，比如，抗叶酸转运方面的改变和（或）突变影响酶结构或亲和力。
材料与仪器
中国仓鼠细胞或生长快的人或小鼠细胞系 氨甲蝶呤钠盐
0.15mol LNaCl
组织培养瓶 吸管 不含胸苷和次黄嘌呤的培养瓶 倒置显微镜 液氮罐
0.15mol LNaCl
组织培养瓶 吸管 不含胸苷和次黄嘌呤的培养瓶 倒置显微镜 液氮罐
步骤
1. 克隆培养亲代细胞形成生长旺盛、基因型一致的细胞群体，用于筛选。
2. 用无菌 NaCl 0.15 mol/L ( 0.85 % ) 稀释 MTX，临床使用的包装是浓度为 2.5 mg/ml 的溶液。
3. 在几个相同的培养瓶中分别种 2.5×105 个细胞，每个培养瓶中加入不含 MTX 或含 0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.05 μg/ml 和 0.1 μg/ml MTX 的完全培养基，将培养基的 pH 调至 7.4，37°C 培养 5~7 天。
4. 在倒置显微镜下观察细胞，如果培养瓶中出现有一小部分细胞克隆生长，其余的一些细胞是变大的，附着在基质层上的可能要死的细胞，选择这种培养瓶的细胞，换含有相同量 MTX 的新鲜培养基继续培养。
5. 如果需要，可以更换新鲜培养基，再培养 5~7 天，但是细胞必须始终处于 MTX 环境中。当细胞密度达到 2~10×106 个/瓶，将细胞以每瓶 2.5×105 个传入新培养瓶，分别加人原浓度的 MTX 和 2~10 倍原浓度的 MTX 。
6. 5~7 天后观察新传代的和原来加入较高浓度 MTX 的细胞，更换培养基，选择可用细胞，方法同前。
7. 每步传代的细胞用逐步增高的药物浓度持续筛选，直至获得要求的耐药水平。改变而获得低到中等水平耐药、DHFR 活性增加和（或）转运能力改变的中同仓鼠细胞需要 2~3 个月；对于中国仓鼠细胞、小鼠细胞或生长快的人的细胞来说，获得高水平耐药性和酶过度产生的变异株需要 4~6 个月或更长时间。
8. 定期冻存筛选中的细胞于液氮中。
2. 用无菌 NaCl 0.15 mol/L ( 0.85 % ) 稀释 MTX，临床使用的包装是浓度为 2.5 mg/ml 的溶液。
3. 在几个相同的培养瓶中分别种 2.5×105 个细胞，每个培养瓶中加入不含 MTX 或含 0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.05 μg/ml 和 0.1 μg/ml MTX 的完全培养基，将培养基的 pH 调至 7.4，37°C 培养 5~7 天。
4. 在倒置显微镜下观察细胞，如果培养瓶中出现有一小部分细胞克隆生长，其余的一些细胞是变大的，附着在基质层上的可能要死的细胞，选择这种培养瓶的细胞，换含有相同量 MTX 的新鲜培养基继续培养。
5. 如果需要，可以更换新鲜培养基，再培养 5~7 天，但是细胞必须始终处于 MTX 环境中。当细胞密度达到 2~10×106 个/瓶，将细胞以每瓶 2.5×105 个传入新培养瓶，分别加人原浓度的 MTX 和 2~10 倍原浓度的 MTX 。
6. 5~7 天后观察新传代的和原来加入较高浓度 MTX 的细胞，更换培养基，选择可用细胞，方法同前。
7. 每步传代的细胞用逐步增高的药物浓度持续筛选，直至获得要求的耐药水平。改变而获得低到中等水平耐药、DHFR 活性增加和（或）转运能力改变的中同仓鼠细胞需要 2~3 个月；对于中国仓鼠细胞、小鼠细胞或生长快的人的细胞来说，获得高水平耐药性和酶过度产生的变异株需要 4~6 个月或更长时间。
8. 定期冻存筛选中的细胞于液氮中。
来源：丁香实验
