方案 23.7 胰腺上皮细胞分离及培养实验

从豚鼠胰腺组织分离细胞，用纱布或尼龙网过滤细胞悬液，将过滤的细胞悬液轻轻加于 BSA 液上面。通过 3 次连续离心和混悬细胞，使呈团状的细胞分散。然后，将细胞接种于涂有胶原蛋白的培养器皿。

F12K 组织培养液 含有 20% 小牛血清 HBSS HBSS-DVC 葡萄糖 胰蛋白酶液 胰蛋白酶液 枸橼酸缓冲液 凡枸橼酸三钠盐 NaCl 葡萄糖 酚红 胶原蛋白酶液 溶解胶原蛋白酶 硅化锥形瓶 吸管
Blichner 漏斗 透析管 Sidearm 瓶 聚丙烯离心管 纱布 培养皿

材料

1. 无菌

（1）F12K 组织培养液：含有 20% 小牛血清（F12K-CS20)

​（2）HBSS

（3）HBSS-DVC: 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS

（4）葡萄糖（Difco,0155-174,BDBiosciences)

（5）胰蛋白酶液：用枸橼酸缓冲液配制 0.25% 胰蛋白酶液（1:250, Difco, BDBi-osciences)。 枸橼酸缓冲液（pH7.6) 含有 3 g 凡枸橼酸三钠盐、6 g/L NaCl 、5 g/L 葡萄糖和 0.02 g/L 酚红。

（6）胶原蛋白酶液：1800U/ml，用 1XHBSS-DVC (pH 7.2) 溶解胶原蛋白酶 (GIBCO)。调整胶原蛋白酶液的 pH 至 7.2，在 4℃ 条件下用 12Kda 透析膜透析 4 h，透析液为含有 0.2% 葡萄糖的 HBSS-DVC。除去 HBSS 后，用 HBSS-DVC 重复此步骤 16～18 h 。过滤除菌，分装成 10～20 ml，在 70℃ 以下的条件下储存。

（7）25 ml 硅化锥形瓶（Bellco)

（8）吸管：5 或 10 ml, 大口径（Bellco)

（9）Blichner 漏斗 

（10）透析管（SpectroPor)

（11）Sidearm 瓶:250 ml

（12）聚丙烯离心管：50 ml

（13）纱布 

（14）涂有胶原蛋白的培养皿（Biocoat，BD Biosciences)

2. 非灭菌

（1）水浴振荡器（M5B 型，11-22-1，Backer)

（2）离心机

操作步骤

1. 配制胶蛋白原酶和胰蛋白酶（1:2) 混合消化液，加热至 37°C 。

2. 在无菌条件下取出整个胰腺（0.5～1 g )，放人 F12K -CS20 中。

3. 剪除肠系膜和其他组织，将胰腺切成 1～3 mm 小块。

4. 将组织块移人盛有 5 ml 预热的混合消化液的 25 ml 硅化锥形瓶，在 37℃ 条件下用水浴振荡器振荡消化（120r/min ,15 min )。加人新鲜消化液，重复此步骤 2～3 次，直至大部分组织被消化分散。

5. 每次振荡消化后，使大的组织块沉下，然后将上清液移入 50 ml 聚丙烯离心管。离心管盛有约 12 ml 冷 F12K-CS20 , 以中和消化液。

6. 离心（600r/min，5 min ) 后，用 5～10 ml 冷 F12K -CS20 混悬细胞，将离心管放在冰上。

7. 收集细胞悬液，经数层灭菌纱布（放人 Blichner 漏斗内）过滤。在过滤过程中，将漏斗柄插入真空瓶，轻轻吸细胞悬液。取少量细胞悬液，做定量分析。

8. 通常情况下，每毫克组织获得 1X10⁵～2X10⁵ 个细胞，90%～95% 细胞为活细胞。

9. 将 5X10⁷～5X10⁸ 个 细胞加到 2～4 个 50 ml 聚丙烯离心管的液柱表面，每个离心管内盛有 35 ml 添加 4% 冷 BSA 的 HBSS-DVC(pH 7.2)。然后，离心 (600r/min，5 min )。此步骤对于有效地将胰腺的腺泡细胞与胰岛细胞、导管细胞和基质细胞分离是至关重要的。吸取上清液，重复此分离步骤 2 次，每次分离后收集细胞，用冷 F12K-CS20 混悬细胞。

10. 用 5～10 ml 冷 F12K-CS20 收集细胞。取少量细胞悬液，计数细胞。每毫克组织获得 2X 10⁴～5X10⁴ 个细胞，80%～95% 细胞为腺泡细胞。接种密度为 3X10⁵ 个细胞/cm²。在 72 h 内，细胞贴壁，形成克隆。