方案 21.1 用血细胞计数板进行细胞计数实验

用胰蛋白酶消化单层培养，或从悬浮培养中取样；准备一张盖玻片，将细胞加到血细胞计数板的小室内。在显微镜下计数细胞，计算细胞浓度。

材料
无菌：D-PBSA、0.25% 粗制胰蛋白酶、生长培养基、移液器黄吸头
非无菌：移液器，20ul 或 100ul 可调式、血细胞计数板（改良的 Neubauer）、数字计数器、显微镜

操作步骤

1. 细胞取样

（a）单层培养

（i）如常规培养那样用胰酶消化单层培养的细胞（见方案 13.2），用培养基重悬细胞至浓度约 1X10⁶ 个/ml。对样本进行计数时，不用将胰酶消化液去除，可用胰酶液将细胞吹打分散，直接进行计数。如果细胞聚团，可用含血清的培养基进行倍比稀释（50:50）再计数。

（ii）充分地混匀细胞悬液使之尽量分散成单个细胞，转移一小部分样本（约 1 ml）至小瓶或常用容器中。

（b）悬浮培养

（i）充分地混匀细胞悬液使细胞尽量分散不聚集。

（ii）转移 1 ml 的细胞悬液至小瓶或常用容器中。

在本方法中，所需要的细胞最低浓度大致为 1X10⁶ 个/ml。因而细胞悬液需要被离心（100 g，2 min），然后重悬于一个便于计数的更小的体积之中。

2. 准备血细胞计数板

（a）用 70% 的乙醇清洗计数板表面，注意不要划伤银的表面。

（b）清洗盖玻片，在边缘稍微沾些水，然后将盖玻片压到计数板的凹槽和半银的计数区域上（图 21.1）。当出现干扰图像（「牛顿环」，或在计数板与盖玻片之间出现类似水面上的油滴那样的五颜六色的彩虹环）时，说明盖玻片已被正确放置，计数小室的深度也已被确定。

3. 充分混合细胞样品，用力吹打以分散所有的细胞团块，然后用巴斯德吸管或移液器枪头吸取 20?l 的样品。

4. 立即将细胞悬液移到血细胞计数板小室的边缘，从吸管中挤出细胞悬液，利用毛细作用使之充满计数板和盖玻片的空隙。小室内的液体既不能多，也不能少；以液体刚好流到计数板凹槽的边缘为准，否则由于表面张力的改变，小室的容积将发生改变。

5. 按照上面的操作，将计数板的另一个小室用细胞悬液充满。

6. 洇干多余的液体（但不要带出盖玻片下的细胞悬液），把计数板放在显微镜载物台上。

7. 选择一个 10X 物镜，利用网格线对焦（图 21.1）。如果由于对比弱而使聚焦困难，可以调节可变光阑，减少进入的光线，或者通过偏置聚光器而使光线略微倾斜。

8. 移动计数板，使镜下的视野恰好是整个网络区域中心的一个大方格，而且是你所能看到的以 3 条平行线为界的最大范围。由于目镜的原因，大方格的四个角有可能略微位于视野之外（图 21.1）。

9. 利用更细的划分区域（同样以 3 条平行线分界）和单线网格线来计算这一 1 mm² 范围内的细胞数。为了避免重复计算，压线的细胞只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内。对于常规的传代培养来讲，细胞数在 100 ~300 个/mm² 即可；计数的细胞越多，计算的结果越准确。若要进行需精确定量的实验，所数的细胞数应在 500~1000 个。

（a）如果视野内的细胞过少（<100/mm²），需要额外计算中心大方格周围的一个或多个大方格（每个方格 1 mm²）。
（b）如果视野没的细胞过多（>100/mm²），只需要计算大方格（1 mm²）对角线上的 5 个小方格（每个小方格以 3 条平行线为边界分隔）。

10. 如果计数板有两个小室，可以将第二个小室移入视野内进行第二次计数。或者冲洗计数板，重新加上细胞样品进行再次计数。