原理
EDTA是一种非酶性消化物,常用不含Ca2+和Mg2+的BSS 配成0.02%的工作液。
关于EDTA的作用机制一般认为是:一些组织,尤其是上皮组织,在生存中需要Ca2+和Mg2+才能维持组织的完整性。EDTA能从这些组织生存环境中吸收这些离子,形成螯合物,能促进细胞相互分离。
EDTA 作用比胰蛋白酶缓和,很少用于单独消化新鲜组织(传代细胞可单用),如与胰蛋白酶按不同比例相混合并用,消化作用更好。EDTA 最适消化传代细胞,也多与胰蛋白酶混合使用(1:1 或2:1)。
关于EDTA的作用机制一般认为是:一些组织,尤其是上皮组织,在生存中需要Ca2+和Mg2+才能维持组织的完整性。EDTA能从这些组织生存环境中吸收这些离子,形成螯合物,能促进细胞相互分离。
EDTA 作用比胰蛋白酶缓和,很少用于单独消化新鲜组织(传代细胞可单用),如与胰蛋白酶按不同比例相混合并用,消化作用更好。EDTA 最适消化传代细胞,也多与胰蛋白酶混合使用(1:1 或2:1)。
材料与仪器
营养液
EDTA 胰蛋白酶 Hanks
恒温箱 吸管
EDTA 胰蛋白酶 Hanks
恒温箱 吸管
步骤
用ETDA 和胰蛋白酶混合消化法传代的过程如下
2. 吸出消化液,注入适量Hanks液洗一二次;注意注入时要缓慢,不要让液体直接冲刷细胞多的部位,朝向瓶底或瓶角部为好,以避免把细胞从瓶壁上冲下来,然后手持培养瓶轻轻晃动,让Hanks液体在细胞面上来回流动,以洗掉残余的消化液,不要用力过猛,否则能把附着不牢的细胞冲掉,减少细胞数量;
3. 吸出Hanks液,加入适量培养液后,用吸管吸、吹营养液,反复轻轻吹打瓶壁上细胞,使之脱落入培养液中形成细胞悬液。
1. 吸出培养瓶内营养液,注入EDTA(0.02%)和胰蛋白酶(0.25%)混合液(1:1),注入量以能覆盖细胞为度,置37 ℃温箱或室温中作用3 分~5 分钟。
在消化过程中,要在镜下随时监视细胞状态,当见到细胞胞质回缩,胞体趋于变圆,细胞相互间缝隙变大时,便立即终止消化。
细胞上述变化在已连接成片的细胞最为明显;可见细胞由于胞质回缩,而相互分离,遂失去原来紧密接触关系,出现明显可见的缝隙。如消化过度则细胞能完全从瓶壁脱落,这时需要做离心分离以防细胞丢失,增加了麻烦;
在消化过程中,要在镜下随时监视细胞状态,当见到细胞胞质回缩,胞体趋于变圆,细胞相互间缝隙变大时,便立即终止消化。
细胞上述变化在已连接成片的细胞最为明显;可见细胞由于胞质回缩,而相互分离,遂失去原来紧密接触关系,出现明显可见的缝隙。如消化过度则细胞能完全从瓶壁脱落,这时需要做离心分离以防细胞丢失,增加了麻烦;
2. 吸出消化液,注入适量Hanks液洗一二次;注意注入时要缓慢,不要让液体直接冲刷细胞多的部位,朝向瓶底或瓶角部为好,以避免把细胞从瓶壁上冲下来,然后手持培养瓶轻轻晃动,让Hanks液体在细胞面上来回流动,以洗掉残余的消化液,不要用力过猛,否则能把附着不牢的细胞冲掉,减少细胞数量;
3. 吸出Hanks液,加入适量培养液后,用吸管吸、吹营养液,反复轻轻吹打瓶壁上细胞,使之脱落入培养液中形成细胞悬液。
注意事项
1. 使用EDTA处理细胞后,因血清对其无中和作用,一定要用Hanks液产中洗液,因残留在培养液中的EDTA对细胞能产生不良作用。
来源:丁香实验