原理
胰蛋白酶适于消化细胞间质较小的软组织,如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织,对传代细胞也非常好。
用于消化纤维性组织或较硬的癌组织则较差。Ca2+和Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定抑制作用,故需用不含这些离子的BSS 配制。
血清有抑制胰蛋白酶活性的作用,因此在做细胞传代时,用胰蛋白酶消化细胞后,可不必再用Hanks 液冲洗,直接加入含有血清的培养液进行培养即可。
残留的微量胰蛋白酶即被血清抑活,对细胞没有什么影响。
用于消化纤维性组织或较硬的癌组织则较差。Ca2+和Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定抑制作用,故需用不含这些离子的BSS 配制。
血清有抑制胰蛋白酶活性的作用,因此在做细胞传代时,用胰蛋白酶消化细胞后,可不必再用Hanks 液冲洗,直接加入含有血清的培养液进行培养即可。
残留的微量胰蛋白酶即被血清抑活,对细胞没有什么影响。
材料与仪器
新鲜组织
Hanks 培养液 胰蛋白酶
三角烧瓶 吸管
Hanks 培养液 胰蛋白酶
三角烧瓶 吸管
步骤
使用胰蛋白酶消化细胞法如下:
1. 剪切
把组织剪切成3~5 立方毫米的小块;
2. 加液
把组织置入三角烧瓶中(瓶内有铁蕊的搅棒或玻璃小球),注入比组织量多30~50 倍的0.25%的胰蛋白酶(预加温至37 ℃);
3. 消化
置电磁搅拌器台上,消化30~60 分钟,或置于37 ℃水浴中,或放于37 ℃温箱中;在两种情况下,每隔5~10 分钟摇动一次。如需长时间消化时,中间可更换一次消化液,然后静置三角烧瓶,过10 分钟,待组织下沉后,吸除2/3上清液,余1/3,再补加新胰蛋白酶液,继续消化;
4. 消化完毕,倒入离心管中,800 转/分,离心6~8 分钟后吸除上清液;
5. 用Hanks液漂洗2~3 分钟,离心去上清,共两次;
6. 800 转/分,离心5 分钟后去上清,加入一定量的营养液,通过100 微米/网眼的尼龙网或不锈钢纱网滤过,以除掉未充分消化的较大块的组织;如消化彻底可不过滤。用吸管吸取一滴细胞悬液滴于载物片上观察,如细胞分散良好、形态完整、即可用于培养。滤过时用3~4 层无菌纱布亦可。
1. 剪切
把组织剪切成3~5 立方毫米的小块;
2. 加液
把组织置入三角烧瓶中(瓶内有铁蕊的搅棒或玻璃小球),注入比组织量多30~50 倍的0.25%的胰蛋白酶(预加温至37 ℃);
3. 消化
置电磁搅拌器台上,消化30~60 分钟,或置于37 ℃水浴中,或放于37 ℃温箱中;在两种情况下,每隔5~10 分钟摇动一次。如需长时间消化时,中间可更换一次消化液,然后静置三角烧瓶,过10 分钟,待组织下沉后,吸除2/3上清液,余1/3,再补加新胰蛋白酶液,继续消化;
4. 消化完毕,倒入离心管中,800 转/分,离心6~8 分钟后吸除上清液;
5. 用Hanks液漂洗2~3 分钟,离心去上清,共两次;
6. 800 转/分,离心5 分钟后去上清,加入一定量的营养液,通过100 微米/网眼的尼龙网或不锈钢纱网滤过,以除掉未充分消化的较大块的组织;如消化彻底可不过滤。用吸管吸取一滴细胞悬液滴于载物片上观察,如细胞分散良好、形态完整、即可用于培养。滤过时用3~4 层无菌纱布亦可。
注意事项
1. 在37 ℃温度下用胰蛋白酶长时间(1 小时以上)消化纤维性组织时,组织块表层细胞可随时从纤维网架中脱落下来。
2. 因此每隔20~30 分钟,需用不锈钢网(20~50 微米)滤过一次,离心,收集这些细胞,以免它们被消化过度受破坏。
3. 如系冷消化,在从4 ℃中取出后,亦应先滤过一次,离心,除上清,收集已游离下来的细胞;再向消化容器中寂足新胰蛋白酶液,并再重置入37 ℃温箱中,继续温消化剩余组织20~30 分钟,这样可能效果更好。
2. 因此每隔20~30 分钟,需用不锈钢网(20~50 微米)滤过一次,离心,收集这些细胞,以免它们被消化过度受破坏。
3. 如系冷消化,在从4 ℃中取出后,亦应先滤过一次,离心,除上清,收集已游离下来的细胞;再向消化容器中寂足新胰蛋白酶液,并再重置入37 ℃温箱中,继续温消化剩余组织20~30 分钟,这样可能效果更好。
来源:丁香实验