比色法

最新修订时间：2024-05-13

原理

淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解a-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在722型分光光度计540 nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量，从而求出淀粉酶活力。

材料与仪器

麸皮面粉
NaNO3 KH2PO4 (NH4)2SO4 CaCl2 MgSO4·7H2O CoCl2 FeSO4·7H2O ZnSO4
分光光度计恒温水浴锅生化培养箱磁力搅拌器三角瓶

步骤

一、实验主要仪器设备和材料

分光光度计、恒温水浴锅、生化培养箱、磁力搅拌器、三角瓶、麸皮、面粉、NaNO₃ 、KH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄^.7H₂O、CoCl₂、FeSO_4^·7H₂O、ZnSO₄。

二、实验方法、操作步骤

1. 还原糖的测定

（1）标准曲线的制作

取9支干燥试管编号，按表1所示的量，精确浓度为1.00 mg/ml的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。表中单位为ml。

将各管摇匀，盖上小漏斗，在沸水浴中加热5 min，立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水至 20.5 ml，用橡皮塞塞住管口，混匀。切勿用力振摇，以免引入气泡。在540 nm波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测定1-8号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。

表1 还原糖标准曲线制作

（2）发酵液中残留还原糖的测定

发酵液单层滤纸过滤，滤液0.2 ml定容至100 ml，500倍稀释至含糖量2-8 mg/100 ml为试样。

取4支干燥试管,编号，按表2所示的量，精确加入待测液和试剂(ml)

试剂加入后，其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同，测定出各管溶液的吸光度值。

计算

以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算样品中还原糖的百分含量：

表2 还原糖的测定

2. 氨基态氮的测定

（1）取发酵滤液5.00 ml，置于100 ml烧杯中，加入15 ml水，磁力搅拌器搅拌5 min后，将电位计插入烧杯中，用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH=8.20，此为游离酸度，不予计量。加入10.0 ml甲醛溶液，立即混匀，迅速用0.1 mol/L NaOH标准溶

液滴定至酸度计指示pH=9.20，计下消耗NaOH标准溶液的毫升数。同时用水做空白实验。

（2）计算

氨基氮（%）=（V-V0）×N×0.014×20/5×100

式中： V--加甲醛后试液消耗氢氧化钠体积，ml;

V0--加甲醛后空白液消耗氢氧化钠体积，ml;

M-- NaOH标准溶液的浓度,mol/L；

0.014--与1.00 ml NaOH标准溶液相当的氮的质量，g；

（3）淀粉酶活力的测定及计算

淀粉酶活力（IU/g干培养基）：本实验条件下，每分钟释放出1umol还原糖所需要的酶量称为一个酶活力单位。

（4）总体实验操作流程：

①配制培养基，灭菌，冷却。

②冷却后接种，并搅拌均匀，置于28 ℃培养箱进行培养。

③每隔24 h取样，用0.2 M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）按一定的浸提比进行浸提1 h，离心得粗酶液。共取样6次。

④分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。

三、实验结果

1. 以还原糖浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间还原糖的变化曲线。

2. 以氨基态氮浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间氨基态氮的变化曲线。

3. 以淀粉酶活力为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。

来源：丁香实验