原理
通过使用激发波长及发射波长均不相间的荧光染料而进行的。通常限用两种荧光染料，最常见的是罗丹明（绿光激发，发射红光）和荧光素（蓝光激发、发绿光）联合使用。
材料与仪器
试剂：
① 二甲苯 Ⅰ、Ⅱ
② 乙醇
③ 双蒸水
④ 组织样品第一抗体
⑤ HRP 标记的二抗
⑥ PBS
⑦ 3% H2O2
⑧ 5% BSA
⑨ TSA 试剂
⑩ EDTA 抗原修复缓冲液（PH 8.0）
⑪ DAPI 染色液
器械：
① 玻片
② 加湿盒
步骤
1、脱蜡、水化：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100% 酒精-100% 酒精-95% 酒精-90% 酒精-80% 酒精-70% 酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理。
一般在每个试剂中放 10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间，一般为 12～15 min。
2、PBS 洗两次各 5 min。
3、用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的 3% H2O2 ，室温封闭 5～10 min，蒸馏水洗 3 次 2 min。
4、抗原修复：加入 PBS 缓冲液，放入微波炉中蒸煮 3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
5、PBS 洗 5 min。
6、滴加 5% BSA 封闭液，室温 30 min。甩去多余液体。
7、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4 °C 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
8、加二抗：玻片置于 PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育 50 min。
9、DAPI 复染细胞核：切片用 PBS（PH 7.4）洗涤 3 次，每次 5 min。去除 PBS 后在圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10 min。
10、封片：玻片置于 PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
11、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长 330～380 nm，发射波长 420 nm；FITC 绿光激发波长 465～495 nm，发射波长 515～555 nm；CY3 红光激发波长 510～560 nm，发射波长 590 nm）
注意事项
1. 当进行双标记实验时，最重要的准则是：第一抗体应为不同类型，从而使第二抗体能分别识别之。第一抗体最好是来源于不同免疫动物。
但如使用单克隆抗体，这一要求就有可能达不到，当使用单抗时，不同型的抗体如 IgG 和 IgM，可被第二抗体确切区分。但不同亚类（IgG 1 和 IgG 2）的抗体通常不能被二抗确切区分。
2. 在试图进行双标记实验之前，应进行单标记实验，摸出不同的第一抗体和第二抗体的最佳稀释度。
3. 在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验结果和抗体定位正确后，再进行双染实验。
4. 在试图进行双标记实验之前，应进行单标记实验，摸出不同的第一抗体和第二抗体的最佳稀释度。
常见问题
组织切片做免疫荧光时，背景色重时的两种情况：
一、组织切片因染色过程或组织非特异荧光而出现的背景色
针对第一种问题有以下几点建议：
1. 采用高品质的多聚甲醛固定减少普通甲醛的自发萤光；
2. 切片厚度减薄；
3. 切片贴片后流水冲洗干净减少杂质荧光；
4. 一抗以及二抗漂洗干净（非常重要）；
5. 选用高品质封片介质。
二、拍照时因硬件设施或取景器设置而出现的背景色
针对第二种问题有以下几点建议：
1. 曝光时间的控制；
2. 暗室操作。
来源：丁香实验
