Laemmli凝胶电泳法
最新修订时间：
材料与仪器
蛋白质
Tris·Cl SDS
电泳仪 离心机 真空泵
Tris·Cl SDS
电泳仪 离心机 真空泵
步骤
1. 按厂商的使用指南用两块干净的玻璃平板和0.75 mm 垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上
2. 配置分离胶液体并脱气，然后加10%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。
3. 用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约11 cm 高为止。
4. 用另一根巴斯德吸干，先从一边的垫片，在从另一边垫片往夹层的页面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇。让凝胶在室温聚合30~60 min。
2. 配置分离胶液体并脱气，然后加10%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。
3. 用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约11 cm 高为止。
4. 用另一根巴斯德吸干，先从一边的垫片，在从另一边垫片往夹层的页面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇。让凝胶在室温聚合30~60 min。
5. 倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris·Cl/SDS，pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面
6. 配制积层胶液体，用巴斯德吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至离夹层的顶部约1 cm 高为止。
7. 将0.75 mm 厚的Teflon梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30~45 min。
8. 在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1：1稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸3~5 min。如样品是蛋白质沉淀物，加入50~100 μl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸3~5 min。按供应商的使用指南用1×SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。
9. 小心拔出了Teflon梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳电极缓冲液冲洗加样孔，并以此缓冲液充满之。
10. 按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室，同时往下缓冲液室加入推荐量的1×SDS电极缓冲液。
10. 按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室，同时往下缓冲液室加入推荐量的1×SDS电极缓冲液。
11. 将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电极缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。
12. 用带平嘴针头的25 μl 或100 μl 注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体枳的空白1×DS样品缓冲液，以防相邻泳逭样品的扩散。
14. 连接电源，对于0.75 mm 厚的垂直板电泳，先在10 mA 恒流下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电流调至15 mA继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。
14. 连接电源，对于0.75 mm 厚的垂直板电泳，先在10 mA 恒流下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电流调至15 mA继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。
15. 关闭电源并撤去连接的导线，弃去电极缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。
16. 将凝胶定位以便识别加样的顺序,将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾。
16. 将凝胶定位以便识别加样的顺序,将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾。
17. 小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆撬起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。
18. 小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序。接着就可进行蛋白质的检测。
18. 小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序。接着就可进行蛋白质的检测。
来源：丁香实验
