材料与仪器
病毒原液
G418
离心机 培养箱
G418
离心机 培养箱
步骤
1. 感染的前1天按1：10至1：20将靶细胞NIH 3T3分传于6 cm 培养皿中。
2. 进行感染的当天，移去靶细胞的培养液，加入含有病毒原液的培养液。用1~2 ml 含 有0.01 μl~0.1 ml 病毒原液的培养液感染6 cm 培养中的细胞，或3~5 ml 感染10 cm 培养皿中的细胞。对于鼠源性的或禽源性的E亚群，加800 μg/ml 的polybrene至终浓度8 μg/ml，在37℃温育细胞1~3 h。
3. 用培养液稀释polybrene至2 μg/ml，并培养至少2或3个细胞周期。
4. 如果病毒携带了一个组织化学标记基因如lacZ则感染的细胞可用Xgal染色，不需要进行药物选择。计数蓝染的细胞，接着按步骤7计算滴度。
5. 如果病毒携芾了药物抗性基因，将感染的细胞分传入选择培养液中。如果抗性基因是neo将细胞按1：10至1：20传代，分传入2个各含有G418的10 cm 的培养皿中，培养3天。
5. 如果病毒携芾了药物抗性基因，将感染的细胞分传入选择培养液中。如果抗性基因是neo将细胞按1：10至1：20传代，分传入2个各含有G418的10 cm 的培养皿中，培养3天。
6. 换液，内含适当的选择药物。共培养7~10天，届时应可见到细胞克隆。在克隆扩散之前计数其数目
7. 按如下公式计算滴度（RCFU表示抗性CFU）
7. 按如下公式计算滴度（RCFU表示抗性CFU）
或，如果病毒携带lacZ基因，
粗略的估计是，病毒滴度的变化大于3倍即为有显著差异。
8. 用一种分析方法证明产病毒克隆所产生的病毒没有发生重排或丟失。
8. 用一种分析方法证明产病毒克隆所产生的病毒没有发生重排或丟失。
来源：丁香实验
