材料与仪器
大肠杆菌
LB 顶层琼脂糖 叠氮钠 第一抗体
硝酸纤维素滤膜
LB 顶层琼脂糖 叠氮钠 第一抗体
硝酸纤维素滤膜
步骤
1. 在150 ml LB 平板上滴定λgt11 cDNA文库的滴度，宿主菌为大肠杆菌LE392菌株，每个平板使用7 ml 1%LB顶层琼脂。
2. 选择适当的滴度铺平板，于37℃温育8 h。
2. 选择适当的滴度铺平板，于37℃温育8 h。
3. 将直径132 mm 硝酸纤维素滤膜分别编号，放入上述已培养8 h的平板中，于37℃温育过夜。
4. 用针头刺孔并用印度墨汁在每张滤膜上作一标记，然后取出滤膜。
5. 在室温用免疫筛选缓冲液洗膜30 min，以封闭滤膜并洗去膜上的残留细菌，重复洗涤2~4次。
5. 在室温用免疫筛选缓冲液洗膜30 min，以封闭滤膜并洗去膜上的残留细菌，重复洗涤2~4次。
6. 将第一抗体（稀释于免疫筛选缓冲液中，终浓度为0.5~10 μg/ml）加到装有滤膜的塑料袋中，热封口后置40℃水平摇床上反应2~24 h。
7. 于4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次，毎次5~10 min。
8. 接着将125I 标记的第二抗体（0.5×106 cpm/ml）加入装有滤膜的热封塑料袋中，4℃反应2~6 h。
9. 在4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次，然后用滤纸将滤膜上的液体吸干。
10. 用塑料保鲜膜包裹好滤膜，使用增感屏在-70℃对X光片曝光。
8. 接着将125I 标记的第二抗体（0.5×106 cpm/ml）加入装有滤膜的热封塑料袋中，4℃反应2~6 h。
9. 在4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次，然后用滤纸将滤膜上的液体吸干。
10. 用塑料保鲜膜包裹好滤膜，使用增感屏在-70℃对X光片曝光。
11. 通过反复稀释，纯化λ噬菌体cDNA融合蛋白克隆，最终获得单一的阳性克隆。
12. 培养阳性克隆，制备重组λ噬菌体DNA。
12. 培养阳性克隆，制备重组λ噬菌体DNA。
来源：丁香实验
