细胞培养技术（肿瘤细胞诱导血管生成模型实验）

无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤，一旦生长直径超过 1~2 mm，都会有血管生成。这是由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子，诱导血管生成。

肿瘤细胞；
DEM、藻酸钠、NaCl、EDTA、CaCl₂、台盼蓝、甲醛；
离心机、分光光度计、γ 计数仪；

1、用 DEM 培养液洗涤对数生长期的肿瘤细胞，收集并重新悬浮细胞于 DEM 培养液中。

2、悬浮的肿瘤细胞与 1.2% 藻酸钠溶液混合，稀释后的藻酸钠浓度为 0.8%，细胞浓度为（1~5）x10⁶ 细胞/ml。

3、把 0.8% 藻酸钠的肿瘤细胞稀释液装入喷雾器内，用力使液体压出喷嘴。

4、当水溶性的藻酸钠与 80 mmol/l CaCl₂ 混合，Na⁺ 被 Ca²⁺ 取代后变成胶。

5、空气压力和喷出的速度决定藻酸钠胶粒的大小，可用培养液或 0.15 mol/ NaCl 漂洗胶粒。

6、加入 0.5 ml 含有 1% EDTA 的 0.9% NaCl 溶液至 0.5 ml 藻酸钠包埋的细胞中。

7、EDTA 能破坏 Ca²⁺ 与藻酸的结合键，使胶转变成液体。

8、台盼蓝测定肿瘤细胞。

9、用 50% 的藻酸钠溶液稀释包埋细胞，以便在恒定体积内得到所需的肿瘤细胞数。

10. 用 21 号针沿腹白线皮下注射 200 ul 藻酸钠溶液包埋的肿瘤细胞，以藻酸钠溶液作为对照。

11、3~21 天后，处死动物，从腹部皮下分离出藻酸盐胶粒：

（1）10% 中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，染色，进行组织化学和免疫化学检查。

（2）诸葛将其称重，于室温下载水中浸泡、摇动过夜，采用 Drabkin 分析方法在分光光度计 540 nm 测定上清液中的血红蛋白含量。

（3）在处死动物前 1 h，把 ⁵¹Cr 标记的红细胞从尾静脉注射至小鼠体内。

（4）拉颈处死小鼠后，将分离出的藻酸钠胶粒和远离胶粒的一块组织称重，并用 γ 计数仪测定放射性。