材料与仪器
小鼠
酒精 解剖液 胰蛋白酶 DMEM F12 B27 阿糖胞苷培养液
培养箱
步骤
一、小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤
1. 于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1 min，解剖出完整鼠脑。
2. 预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块。
3. 移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃培养箱中消化30 min。
4. 将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液。
5. 最后再用接种液1 ml混悬，反复吹打（巴氏吸管）混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用。
6. 加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块。
7. 收集含单细胞悬液的上清液约4-5 ml于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，细胞记数；接种1x107个细胞于6孔培养板中。
8. 培养24 h至细胞贴壁后，换全培养液（DMEM/F12+2%B27）培养3d，观察神经元生长状况。
9. 换用阿糖胞苷培养液、 每隔3d换全培养液1次，每次换半液。
二、神经元免疫化学鉴定
1. 4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗涤3次。
2. 加入无水甲醇:30%双氧水（5:1）处理30 min，PBS洗涤3次。
3. 加入5%羊血清封闭20 min，弃去多余液体。
4. 加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神经元特异性烯醇化酶），培养箱中孵育2-4 h，PBS洗涤3次。
6. 加入DAPI染液（1:40），室温放置5-10 min；PBS洗涤3次。
7. 荧光显微镜观察。
三、结果
图1： 刚接种时细胞图
图2： 刚接种时细胞图培养1d后
图3： 刚接种时细胞图培养2d后
图4： 刚接种时细胞图培养3d后
图5： 刚接种时细胞图培养4d后
图6： 刚接种时细胞图培养5d后
图7： 刚接种时细胞图培养6d后
图8：第7d免疫鉴定图
来源：丁香实验
