原理
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
材料与仪器
组织
胰蛋白酶 胶原酶 小牛血清 完全培养基 RPMI-1640培养基
水浴锅 培养瓶 培养箱
胰蛋白酶 胶原酶 小牛血清 完全培养基 RPMI-1640培养基
水浴锅 培养瓶 培养箱
步骤
一、剪碎组织，切成1-2 mm3 小块中，加入0.25%胰蛋白酶或2 000 U/ml胶原酶。
二、在37℃水浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。
三、以（5-10）x108 个/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2 下分瓶（或皿）中培养。
二、在37℃水浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。
三、以（5-10）x108 个/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2 下分瓶（或皿）中培养。
注意事项
一、注意污染
1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
3、吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
常见问题
一、肿瘤细胞培养成功关键
肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。
肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。
1. 要点
（1）取材
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于 4℃中，但不宜栽过 24小时。
2. 培养基
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
3. 成纤维细胞的排除
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。
二、成纤维细胞排除法
1. 机械刮除法
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：
（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；
（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
（3）用 Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。
2. 反复贴壁法
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗 2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；
（2）取编号为此 A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入 A培养瓶中。置温箱中静止培养 5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入 B培养瓶中后；向 A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；
（3）培养B瓶中细胞 5～20分钟后，接处理 A的方法，把培养液注入 C培养瓶中；再向 B瓶中补加完全培养基。
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见 A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3. 消化排除法
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：
（1）先是用 0.5%胰蛋白酶和 0.02% EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
4. 胶原酶消化法
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
（1）可用 0.5 mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；
（2）用 Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
来源：丁香实验
