原理
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点,通过消化进行选择。可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理,边消化边在倒置显微镜下窥视,当发现成纤维细胞被除掉后,即终止消化;用Hanks洗涤处理一次后,更换新培养液,继续培养,可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净,可再次重复。
材料与仪器
组织
胰蛋白酶 胶原酶 小牛血清 完全培养基 RPMI-1640培养基
水浴锅 培养瓶 培养箱
胰蛋白酶 胶原酶 小牛血清 完全培养基 RPMI-1640培养基
水浴锅 培养瓶 培养箱
步骤
一、剪碎组织,切成1-2 mm3 小块中,加入0.25%胰蛋白酶或2 000 U/ml胶原酶。
二、在37℃水浴中消化30min或更长一些,去除消化液,用洗液洗3次,培养基洗1次后,用完全培养基悬浮,并用吸管吹打分散制成细胞悬液,计数。
三、以(5-10)x108 个/L细胞浓度,在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中,在37℃、5%CO2 下分瓶(或皿)中培养。
二、在37℃水浴中消化30min或更长一些,去除消化液,用洗液洗3次,培养基洗1次后,用完全培养基悬浮,并用吸管吹打分散制成细胞悬液,计数。
三、以(5-10)x108 个/L细胞浓度,在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中,在37℃、5%CO2 下分瓶(或皿)中培养。
注意事项
一、注意污染
1、严格进行动物皮肤消毒,使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒,成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作,防止细菌、霉菌、支原体污染,避免化学物质污染。自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
3、吸取液体前,瓶口和吸管进行火焰消毒;吸取液体时,避免瓶口和吸管碰撞。
4、离心管入台前,管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时,要随时用肘部关闭工作窗。
6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后,移入另一个器皿中继续消毒,在浸泡器械时剪刀口要叉开放,镊子弯头要向下放,并加盖消毒。凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入。
二、器材使用时既要注意用火焰消毒,又要防止烫伤、烫死细胞。经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
常见问题
一、肿瘤细胞培养成功关键
肿瘤细胞培养成功关键在于:取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面,肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别,初代培养应用组织块和消化培养法均可。
肿瘤细胞培养成功关键在于:取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面,肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别,初代培养应用组织块和消化培养法均可。
1. 要点
(1)取材
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要,体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区,取材时尽量避免用退变组织,要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养,如因故不能立即培养,可贮存于 4℃中,但不宜栽过 24小时。
2. 培养基
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格,一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低,正常细胞培养不加血清不能生长,肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子;肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等)。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
3. 成纤维细胞的排除
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长,致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快,最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。
二、成纤维细胞排除法
1. 机械刮除法
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)、或裹少许脱脂棉制成,装入试管中高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为:
(1)标记:镜下观察,用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位;
(2)刮除:弃掉培养液,把无菌胶刮伸入瓶皿中,肉眼或显微镜窥视下,刮除无标记空间;
(3)用 Hanks液冲洗一两次,洗除被刮掉的细胞;
(4)注入培养液继续培养,如发现仍有成纤维细胞残留,可重复刮除至完全除掉为止。
2. 反复贴壁法
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点,并结合使用不加血清的营养液,把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁,使两类细胞相互分离,操作方法与传代相同。
(1)待细胞生长达一定数量后,倒出旧培养液,用胰酶消化后,Hanks 冲洗 2次,加入不含血清的培养液,吹打制成细胞悬液;
(2)取编号为此 A、B、C三个培养瓶;首先把悬液接种入 A培养瓶中。置温箱中静止培养 5~20分钟后,轻轻倾斜培养瓶,让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液,再接种入 B培养瓶中后;向 A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养;
(3)培养B瓶中细胞 5~20分钟后,接处理 A的方法,把培养液注入 C培养瓶中;再向 B瓶中补加完全培养基。
当三个瓶内都含有培养液后,均在温箱中继续培养。如操作成功,次日观察可见 A瓶主要为成纤维细胞,B瓶两类细胞相杂,C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次,直至癌细胞纯化为止。
3. 消化排除法
此法曾用于乳癌细胞的培养,具体程序是:
(1)先是用 0.5%胰蛋白酶和 0.02% EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次,然后再换成新的混合液继续消化,并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶,到半数细胞脱落下来后,便立即停止消化;
(2)把消化液吸入离心管中,离心去上清,吸入另瓶中,加培养液置温箱中培养;向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后,成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理,可能把成纤维细胞除净。
4. 胶原酶消化法
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点,通过消化进行选择。
(1)可用 0.5 mg/ml的胶原酶消化处理,边消化边在倒置显微镜下窥视,当发现成纤维细胞被除掉后,即终止消化;
(2)用 Hanks洗涤处理一次后,更换新培养液,继续培养,可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净,可再次重复。
来源:丁香实验