原理
利用逆转录病毒转染法将增强型绿色荧光蛋白基因导入人肺癌大细胞系NCI-H460，采用外科原位移植法建立肺癌原位移植模型。定期通过小动物活体荧光成像系统观察肿瘤生长，利用相关性检验分析荧光面积和肿瘤体积之间的相关关系，并观察原位移植术后裸鼠的生存期和肿瘤转移情况。
材料与仪器
BALB cnu nu裸鼠 人非小细胞肺癌NCI-H460
EGFP表达载体 大小鼠专用颗粒饲料 胎牛血清 生理盐水 青霉素 链霉素 RPM1-1640培养基
醋酸纤维滤膜 C孵育箱 96孔板 针头 注射器 镊子 棉签 净化工作台 剪刀
EGFP表达载体 大小鼠专用颗粒饲料 胎牛血清 生理盐水 青霉素 链霉素 RPM1-1640培养基
醋酸纤维滤膜 C孵育箱 96孔板 针头 注射器 镊子 棉签 净化工作台 剪刀
步骤
一、 实验材料准备
BALB/c（nu/nu）裸鼠，雌雄不限。4周龄-6周龄，22只，体重18 g-22 g。所有裸鼠在SPF级屏障系统中饲养并进行实验（。饲养室相对湿度为（55±10）%，温度为（22±2）℃，光照12 h明暗交替，裸鼠饲养用的饲料为钴60辐射灭菌过的大小鼠专用颗粒饲料（江苏省协同医药生物工程有限公司）。
BALB/c（nu/nu）裸鼠，雌雄不限。4周龄-6周龄，22只，体重18 g-22 g。所有裸鼠在SPF级屏障系统中饲养并进行实验（。饲养室相对湿度为（55±10）%，温度为（22±2）℃，光照12 h明暗交替，裸鼠饲养用的饲料为钴60辐射灭菌过的大小鼠专用颗粒饲料（江苏省协同医药生物工程有限公司）。
二、 表达绿色荧光蛋白的H460肺癌细胞系的建立
1. 在含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的RPM1-1640上清液中培养PT67包装细胞。
2. 当细胞达到80%-90%融合浓度时收集培养液，经孔径为0.45 um的醋酸纤维滤膜过滤后备用。
3. 转染前24 h更新NCI-H460新鲜培养基，加入含逆转录病毒液的培养基转染4 h后，置于37℃孵育箱孵育36 h，在荧光显微镜下观察荧光。
4. 收集转染细胞，在含200 ug/mL的G418选择性培养基培养细胞。
5. 逐步将G418浓度增加200 ug/mL-400 ug/mL，直至抗性克隆形成。
6. 用96孔板单个细胞分离方法分离高表达GFP的克隆株，混合分离克隆株，使用常规方法扩增。
7. 经体外连续传代培养3个月，检测荧光的表达强度。
2. 当细胞达到80%-90%融合浓度时收集培养液，经孔径为0.45 um的醋酸纤维滤膜过滤后备用。
3. 转染前24 h更新NCI-H460新鲜培养基，加入含逆转录病毒液的培养基转染4 h后，置于37℃孵育箱孵育36 h，在荧光显微镜下观察荧光。
4. 收集转染细胞，在含200 ug/mL的G418选择性培养基培养细胞。
5. 逐步将G418浓度增加200 ug/mL-400 ug/mL，直至抗性克隆形成。
6. 用96孔板单个细胞分离方法分离高表达GFP的克隆株，混合分离克隆株，使用常规方法扩增。
7. 经体外连续传代培养3个月，检测荧光的表达强度。
三、原位移植模型的建立
1. 将H460-GFP细胞悬浮于PBS液中，调整细胞浓度为5x106/mL。
2. 消毒裸鼠左侧腋下皮肤，将0.2 mL细胞悬液用1 mL带有27G1/2针头的注射器接种于2只裸鼠皮下，形成一皮丘，干棉签压迫。
3. 当皮下移植瘤长至直径约10 mm时剥取移植瘤，选择生长良好、瘤结无破溃的荷瘤裸鼠，在净化工作台内，无菌操作下完整剥离瘤结，生理盐水洗去血渍。
4. 剪开瘤结，清除中心的坏死组织，剪成直径约1 mm大小的米粒样小瘤块。
5. 20只裸小鼠接受外科原位移植术。
6. 异氟烷吸入麻醉，将裸鼠置于右侧卧位，四肢适当固定。
7. 消毒左侧胸壁皮肤，在近第4、5肋间位置的皮肤切一0.4 cm-0.5 cm的横切口，锐性分离胸壁肌肉，暴露肋骨和肋间肌，打开胸腔。
8. 用镊子固定左肺，将准备好的瘤块缝合在左肺上，无菌缝合线缝合关闭胸腔。
9. 立即检查缝合情况，如果漏气，继续缝合，直至胸壁完全缝合。
10. 用5 mL注射器做胸腔内穿刺抽气，缝合胸壁肌肉和皮肤。
11. 裸鼠放回原饲养笼，继续饲养。
2. 消毒裸鼠左侧腋下皮肤，将0.2 mL细胞悬液用1 mL带有27G1/2针头的注射器接种于2只裸鼠皮下，形成一皮丘，干棉签压迫。
3. 当皮下移植瘤长至直径约10 mm时剥取移植瘤，选择生长良好、瘤结无破溃的荷瘤裸鼠，在净化工作台内，无菌操作下完整剥离瘤结，生理盐水洗去血渍。
4. 剪开瘤结，清除中心的坏死组织，剪成直径约1 mm大小的米粒样小瘤块。
5. 20只裸小鼠接受外科原位移植术。
6. 异氟烷吸入麻醉，将裸鼠置于右侧卧位，四肢适当固定。
7. 消毒左侧胸壁皮肤，在近第4、5肋间位置的皮肤切一0.4 cm-0.5 cm的横切口，锐性分离胸壁肌肉，暴露肋骨和肋间肌，打开胸腔。
8. 用镊子固定左肺，将准备好的瘤块缝合在左肺上，无菌缝合线缝合关闭胸腔。
9. 立即检查缝合情况，如果漏气，继续缝合，直至胸壁完全缝合。
10. 用5 mL注射器做胸腔内穿刺抽气，缝合胸壁肌肉和皮肤。
11. 裸鼠放回原饲养笼，继续饲养。
四、 监测指标
1. 术后每天观察裸鼠有无并发症及异常情况（活动，神经功能，呼吸，动物外观）。
2. 肿瘤种植后每周麻醉处死2只裸鼠，共4周。
3. 锐性分离左侧皮肤肌肉。
4. 在荧光体视显微镜下打开胸腔和腹腔，分别在自然光源和荧光激发状态下拍照。
5. 使用小动物活体成像系统检测GFP的表达，发射波长为520 nm，激发波长为480 nm，曝光时间为1 s，IPP软件定量分析荧光面积。
6. 观察原位移植瘤生长情况，经典方法测量肿瘤体积：用游标卡尺测量肿瘤的最长径（a）和与之垂直的最短径（b），根据公式计算肿瘤体积：肿瘤体积（V）=ab2/2（a、b以mm为单位）。
7. 以肿瘤接种天数为横坐标，肿瘤接种部位荧光面积为纵坐标，绘制原位肿瘤生长曲线。
8. 其余裸鼠每周打开胸部皮瓣，戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，或者用手固定裸鼠，在自然光源和荧光激发状态下拍照。
9. 当裸鼠出现恶病质后，解剖荷瘤鼠，肉眼观察肿瘤生长情况及周围脏器受累情况，并拍照。
2. 肿瘤种植后每周麻醉处死2只裸鼠，共4周。
3. 锐性分离左侧皮肤肌肉。
4. 在荧光体视显微镜下打开胸腔和腹腔，分别在自然光源和荧光激发状态下拍照。
5. 使用小动物活体成像系统检测GFP的表达，发射波长为520 nm，激发波长为480 nm，曝光时间为1 s，IPP软件定量分析荧光面积。
6. 观察原位移植瘤生长情况，经典方法测量肿瘤体积：用游标卡尺测量肿瘤的最长径（a）和与之垂直的最短径（b），根据公式计算肿瘤体积：肿瘤体积（V）=ab2/2（a、b以mm为单位）。
7. 以肿瘤接种天数为横坐标，肿瘤接种部位荧光面积为纵坐标，绘制原位肿瘤生长曲线。
8. 其余裸鼠每周打开胸部皮瓣，戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，或者用手固定裸鼠，在自然光源和荧光激发状态下拍照。
9. 当裸鼠出现恶病质后，解剖荷瘤鼠，肉眼观察肿瘤生长情况及周围脏器受累情况，并拍照。
五、统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行统计分析，荧光面积和肿瘤体积用Mean±SD表示，Pearson相关性检验分析活体肿瘤面积与肿瘤体积之间的相关性，以P<0.05为差异具有统计学意义。
注意事项
1．要设计不同的实验组和对照组， 每组动物数一般为 5-10 只；
2．一般接种肿瘤6-8 周后，小鼠的肿瘤可生长至直径为 15-20mm ( 即小鼠会濒临死亡) 时， 可眼球取血，分离血清并保存血清， 处死小鼠， 取肿瘤组织照相， 取部分肿瘤组织作 冰冻组织切片( 或- 80℃ 保存)， 作相应的免疫组织化学染色 ， 取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定， 石腊包埋， 作常规HE 染色。
常见问题
一、实验讨论
体内移植模型是肿瘤实验研究的主要方法。1969年Rygaard等首次成功地在裸小鼠中移植人结肠癌以后，人们开始利用裸小鼠进行肿瘤移植的研究。皮下移植动物模型及转基因动物模型均不能很好地体现临床转移和药物敏感性。1991年Fu等创立了外科原位移植方法，它采用的移植物直接来自新鲜外科标本或者移植性人肿瘤细胞或瘤细胞系，通过手术将肿瘤原位移植至裸鼠体内建立肿瘤模型。众多学者通过前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等原位移植瘤的动物实验模型证实原位移植模型技术是一种巨大的进步，它的转移率和转移模式更接近于临床。
体内移植模型是肿瘤实验研究的主要方法。1969年Rygaard等首次成功地在裸小鼠中移植人结肠癌以后，人们开始利用裸小鼠进行肿瘤移植的研究。皮下移植动物模型及转基因动物模型均不能很好地体现临床转移和药物敏感性。1991年Fu等创立了外科原位移植方法，它采用的移植物直接来自新鲜外科标本或者移植性人肿瘤细胞或瘤细胞系，通过手术将肿瘤原位移植至裸鼠体内建立肿瘤模型。众多学者通过前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等原位移植瘤的动物实验模型证实原位移植模型技术是一种巨大的进步，它的转移率和转移模式更接近于临床。
1994年Chalfie等首次在大肠埃希菌和线虫中表达GFP，开创了GFP应用研究的先河。近年来，绿色荧光蛋白已成为应用最为广泛的标记性蛋白质之一。GFP基因表达的绿色荧光蛋白受到蓝光或紫光照射时可自发地发出绿色荧光，荧光信号强度高，易于被捕获，无需其它底物或辅助因子的协助便可直接通过荧光显微镜或流式细胞仪等进行检测，观察直观方便；同时，还具有稳定性好、耐受性强、对组织或细胞无毒性和易于构建载体等优点。因此，GFP在肿瘤的生长、疗效评价等方面均已获得广泛应用。
活体动物体内光学成像技术将GFP基因直接转染至肿瘤细胞，根据荧光蛋白的观测和定量分析直接反映研究细胞的生物学特性。荧光蛋白内在的生色团，在简单的仪器如带有窄带过滤片和激发滤波片的蓝色发光二极管照射下，能发射蓝色激发光，激发荧光蛋白发光。观察者通过合适的看片灯和约490 nm波长的导光纤维光转移。随着研究人员对荧光蛋白的深入探讨，发现发射光谱在近红外波段的荧光蛋白更适合深部动物组织成像。红色荧光蛋白产生的荧光显像将更敏感，周围组织的吸收和散射减少。目前已发现的最亮的荧光蛋白是一种叫Katushka的红色荧光蛋白，发射波长超过620 nm，具有快速成熟、高pH稳定性和光稳定性的特点，将来可能会使肺部肿瘤活体动物的非侵入全身成像成为现实。
综上所述，本实验利用SOI法构建的表达绿色荧光蛋白的肺癌裸鼠原位模型，通过观察绿色荧光蛋白能够客观评价NCI-H460-EGFP细胞在裸小鼠体内的生长情况，从而发现肉眼无法发现的微小转移灶，在探索肺癌的生长、转移等机制的研究中有重要的价值。同时本研究还证实了在该模型中可以通过测量荧光面积推测肿瘤体积，从而定量分析肿瘤在体内的生长情况，为药物治疗的临床前研究提供新的实验工具。
来源：丁香实验
