材料与仪器
毒株 标准血清
牛血清Hanks 氏液 琼脂糖
水浴锅 24孔板 孵箱
牛血清Hanks 氏液 琼脂糖
水浴锅 24孔板 孵箱
步骤
一、试验目的
血清分型。
二、实验材料准备
血清分型。
二、实验材料准备
1. 标本
出血热恢复期病人血清
出血热恢复期病人血清
2. 材料
（1） 毒株 汉滩病毒标准株 76-118，汉城病毒标准株 Seoul；
（2）标准血清 兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清；
（3）空斑减少中和试验常用试剂。
三、步骤
1. 将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1：10，56℃灭活30分钟；
2. 进一步2倍稀释血清成1：20、1：40、1：80……，对照血清1：10稀释；
3. 稀释两种病毒（在冰浴中进行）至含200 pfu/ml；
4. 各连续稀释度血清分别与200 pfu/ml的两种病毒液等量混合（各0.3 ml），置37℃中作用1小时（每15分钟振荡一次）；
5. 吸出各细胞培养孔中维持液；
6. 接种长满单层的Vero-E6细胞（24孔板），每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ，每稀释度两孔，100 ul/孔。37℃吸附1小时，每隔15分钟摇动一次；
7. 加第一层琼脂糖覆盖液（需冷置42℃左右），每孔1 ml，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培养7-9天；
8. 加第二层含中性红琼脂糖覆盖液，1 ml/孔，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培养2-5天，从第二天开始观察空斑数；
9. 抗体滴度的判定，以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度；
10. 型别判定：根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分，如果一份血清与汉滩病毒 （或汉城病毒）反应的抗体滴度高于与汉城病毒（汉滩病毒）的抗体滴度4倍或以上，即判为汉滩病毒型，反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时，则不好分型。不足4倍时亦不能定型。
四、配方
1. 第一层琼脂糖覆盖液
2. 第二层琼脂糖覆盖液 基本上同第一层琼脂糖覆盖液，仅将灭活胎牛血清改为5 ml，另加中性红溶液1 ml（333.0 ug/L中性红钠盐Gibco）。
来源：丁香实验
