交叉保护中和实验

一、试验目的

血清分型。

二、实验材料准备
 

1.  标本

出血热恢复期病人血清

2.  材料
 

（1） 毒株 汉滩病毒标准株 76-118，汉城病毒标准株 Seoul；
 

（2）标准血清 兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清；
 

（3）空斑减少中和试验常用试剂。
 

三、步骤
 

1.  将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1：10，56℃灭活30分钟；
 

2.  进一步2倍稀释血清成1：20、1：40、1：80……，对照血清1：10稀释；
 

3.  稀释两种病毒（在冰浴中进行）至含200 pfu/ml；
 

4.  各连续稀释度血清分别与200 pfu/ml的两种病毒液等量混合（各0.3 ml），置37℃中作用1小时（每15分钟振荡一次）；
 

5.  吸出各细胞培养孔中维持液；
 

6.  接种长满单层的Vero-E6细胞（24孔板），每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ，每稀释度两孔，100 ul/孔。37℃吸附1小时，每隔15分钟摇动一次；
 

7.  加第一层琼脂糖覆盖液（需冷置42℃左右），每孔1 ml，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO₂孵箱培养7-9天；
 

8.  加第二层含中性红琼脂糖覆盖液，1 ml/孔，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO₂孵箱培养2-5天，从第二天开始观察空斑数；
 

9.  抗体滴度的判定，以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度；
 

10.  型别判定：根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分，如果一份血清与汉滩病毒 （或汉城病毒）反应的抗体滴度高于与汉城病毒（汉滩病毒）的抗体滴度4倍或以上，即判为汉滩病毒型，反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时，则不好分型。不足4倍时亦不能定型。
 

四、配方
 

1.  第一层琼脂糖覆盖液
 

 

2.  第二层琼脂糖覆盖液 基本上同第一层琼脂糖覆盖液，仅将灭活胎牛血清改为5 ml，另加中性红溶液1 ml（333.0 ug/L中性红钠盐Gibco）。