交叉保护中和实验

 

试验目的  血清分型

标本   出血热恢复期病人血清

材料

1、 毒株   汉滩病毒标准株 76－118，汉城病毒标准株 Seoul；

2、标准血清   兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清；

3、空斑减少中和试验常用试剂。

步骤

1、将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1：10，56℃灭活30分钟；

2、进一步2倍稀释血清成1：20、1：40、1：80……，对照血清1：10稀释；

3、稀释两种病毒（在冰浴中进行）至含200pfu/ml；

4、各连续稀释度血清分别与200pfu/ml的两种病毒液等量混合（各0.3ml），置37℃中作用1小时（每15分钟振荡一次）；

5、吸出各细胞培养孔中维持液；

6、接种长满单层的Vero-E6细胞（24孔板），每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ，每稀释度两孔，100ul/孔。37℃吸附1小时，每隔15分钟摇动一次；

7、加第一层琼脂糖覆盖液（需冷置42℃左右），每孔1ml，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO₂ 孵箱培养7-9天；

8、加第二层含中性红琼脂糖覆盖液，1ml/孔，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO₂ 孵箱培养2-5天，从第二天开始观察空斑数；

9、抗体滴度的判定，以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度；

10、型别判定：根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分，如果一份血清与汉滩病毒 （或汉城病毒）反应的抗体滴度高于与汉城病毒（汉滩病毒）的抗体滴度4倍或以上，即判为汉滩病毒型，反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时，则不好分型。不足4倍时亦不能定型。

配方

1、第一层琼脂糖覆盖液

 

2×Eagle MEM液	50ml（Gibco-BRL）
灭活胎牛血清	10ml
L-谷氨酰胺	4ml（200mmol/L,100X）
MEM非必需氨基酸	1ml（Gibco,100x）
1mol/L HEPES缓冲液	2ml
青链霉素	1ml（青霉素10000u/ml,链霉素10000ug/ml）
制霉菌素（一般可以不加）	0.1ml
临用前配制，放入42℃水浴中，另取
琼脂糖	0.6g（Sigma, Type II medium EEO）
超纯水	34ml（适用于细胞培养的纯化水）
8磅高压灭菌15min，置42℃水浴15min，加入上述配制的组分中，即可使用。

 

2、第二层琼脂糖覆盖液   基本上同第一层琼脂糖覆盖液，仅将灭活胎牛血清改为5ml，另加中性红溶液1ml（333.0ug/L中性红钠盐Gibco）。