交叉保护中和实验
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试验目的 血清分型
标本 出血热恢复期病人血清
材料
1、 毒株 汉滩病毒标准株 76-118,汉城病毒标准株 Seoul;
2、标准血清 兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清;
3、空斑减少中和试验常用试剂。
步骤
1、将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1:10,56℃灭活30分钟;
2、进一步2倍稀释血清成1:20、1:40、1:80……,对照血清1:10稀释;
3、稀释两种病毒(在冰浴中进行)至含200pfu/ml;
4、各连续稀释度血清分别与200pfu/ml的两种病毒液等量混合(各0.3ml),置37℃中作用1小时(每15分钟振荡一次);
5、吸出各细胞培养孔中维持液;
6、接种长满单层的Vero-E6细胞(24孔板),每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ,每稀释度两孔,100ul/孔。37℃吸附1小时,每隔15分钟摇动一次;
7、加第一层琼脂糖覆盖液(需冷置42℃左右),每孔1ml,室温下待凝固,细胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培养7-9天;
8、加第二层含中性红琼脂糖覆盖液,1ml/孔,室温下待凝固,细胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培养2-5天,从第二天开始观察空斑数;
9、抗体滴度的判定,以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度;
10、型别判定:根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分,如果一份血清与汉滩病毒 (或汉城病毒)反应的抗体滴度高于与汉城病毒(汉滩病毒)的抗体滴度4倍或以上,即判为汉滩病毒型,反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时,则不好分型。不足4倍时亦不能定型。
配方
1、第一层琼脂糖覆盖液
2×Eagle MEM液 | 50ml(Gibco-BRL) |
灭活胎牛血清 | 10ml |
L-谷氨酰胺 | 4ml(200mmol/L,100X) |
MEM非必需氨基酸 | 1ml(Gibco,100x) |
1mol/L HEPES缓冲液 | 2ml |
青链霉素 | 1ml(青霉素10000u/ml,链霉素10000ug/ml) |
制霉菌素(一般可以不加) | 0.1ml |
临用前配制,放入42℃水浴中,另取 | |
琼脂糖 | 0.6g(Sigma, Type II medium EEO) |
超纯水 | 34ml(适用于细胞培养的纯化水) |
8磅高压灭菌15min,置42℃水浴15min,加入上述配制的组分中,即可使用。 |
2、第二层琼脂糖覆盖液 基本上同第一层琼脂糖覆盖液,仅将灭活胎牛血清改为5ml,另加中性红溶液1ml(333.0ug/L中性红钠盐Gibco)。