农杆菌介导的小麦新鲜离体幼胚的转化实验

植物学实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

农杆菌介导法是继传统基因枪法后另一种可行的小麦遗传转化方法。它具有操作简单、整合拷贝数低等优点，且对特定的硬粒小麦、春性及冬性面包小麦等品种具有同等转化效率。本实验来源「麦类作物转基因技术与田间鉴定实验指南」〔英〕H.D.琼斯 P.R .休里主编。

来源：丁香实验

操作方法

根癌农杆菌菌液的准备

1. 从根癌农杆菌甘油原液中吸取 400 μl 加入含 10 ml MG/L 液体培养基并添加相应抗生素的 50 ml 无菌管中，28℃、250 r/min 摇床振荡培养过夜（17~20 h) 至 OD600nm =1.0~1. 5。 2. 农杆菌细胞在 4500 g 下离心 10 min 后，弃上清（见注 4 )，用 4 ml 的 1X 侵染培养基重悬农杆菌细胞。 3. 将重悬后含农

根癌农杆菌接种外植体的准备（见注 6)

1. 面包小麦和硬粒小麦开花后 12~16 天剪下幼穗，将种子幼体用 70% ( V/V）的乙醇浸泡 1 min，再换用 10% 乙醇（V/V）轻轻晃动 10 min 进行表面消毒，最后用足量的灭菌蒸馏水冲洗三次以上（见注 7) 。 2. 在层流罩超净台上，借助体视显微镜从种子幼体中分离出幼胚（见注 8) 。用锋利的手术刀除去胚轴。 3. 将幼胚盾片朝上接入直径 55 mm 或 60 mm、盛

幼胚的接种

1. 幼胚盾片接种于侵染培养基后，从摇床上取出一管菌液（见注 9），向管中加入 60 μl 1%（V/V）的 Silwet，至终浓度为 0.015%。 2. 完成 3.2 节的步骤 3 后，立即将离心管中所有的农杆菌菌液（4 ml) 倒入已接种幼胚盾片的培养皿中 [见注 10，图 5.1 (a )]。 3. 将培养皿转移至黑暗条件下放置 15 min 至 3 h ( 见注 11)。在此期间

胚性愈伤的诱导和再生

1. 共培养 2~3 天后，将胚转移至诱导培养基以诱导胚性愈伤（表 5.1，诱导培养基 a 适用于面包小麦，诱导培养基 b 适用于硬粒小麦）。记录下转移的胚的个数以便计算转化效率，转移时确保胚的盾片仍朝上。22~23℃ 避光培养。 2. 3~4 周后，再将胚性愈伤组织转移至再生培养基（表 5.1)，12 h 光照/12 h 黑暗条件下培养 3~4 周（见注 13) 。

选择

1. 将培养物转移至第一轮选择培养基中（表 5.1，选择培养基 1 ) ( 见注 15)。一些愈伤组织在转移时会自然散开，尽管这无关紧要，但放置时应将散开的愈伤块彼此靠近，以标记它们是来自同一幼胚。 2. 培养 3 或 4 周后，筛选出有芽或有根的愈伤组织并将其转入第二轮选择培养基（表 5 . 1 , 选择培养基 2 ) 。此时，愈伤组织已足够大，可以置于 Magenta 培养盒中。与上述的操作

转基因植株的鉴定及种子的收获

1. 经第二轮选择后，挑出根茎生长良好的再生苗（见注 16 ) 移栽于土壤中。首先，将各株再生苗移入 8 cm2 的盆钵里生长 1~2 周，使它们能够逐渐适应温室条件。当小苗足够大时，再取叶片提取 DNA 用于 PCR 和 Southern 杂交分析（见注 17 ) 。 2. 对于冬性小麦品种，装有待定的转基因植株的 Magenta 盒应置于春化室（条件见 2.1 节），6~8 周后，再采用上述

转化效率的计算

1. 转化效率通常用百分比表示。计算方法为：确定的独立转基因单株总数 x100 /侵染的总幼胚数。 2. 如果一个胚得到一株以上的转基因植株，这视为一个独立转化事件，来自同一转化事件的其他所有单株视为姐妹株。这些姐妹株有可能来源于不同的细胞，属于独立转化事件，但只有通过 Southern 杂交分析才能加以确定。所以此法有可能低估了某些转基因实验的转化效率。