染色体分离实验

有丝分裂中细胞的同步化 1. 37℃，用合适的含有 FCS，抗生素和其他必要成分的培养基培养细胞。 2. 收集有丝分裂细胞前 10~16 小时在培养基中以 0.06 μg/ml 的浓度加入秋水仙胺。 收获细胞并在聚胺缓冲液中裂解 3. 收获细胞。 对于悬浮培养细胞（500 ml 培养基），室温 1500 g 离心 5 分钟收获细胞。在室温用聚胺缓冲液清洗三次所得到的沉淀，1500 g

1. 像聚胺法的第 1、2 步中讲的那样诱导悬浮或单层培养细胞的中期阻遏状态。 2. 细胞在 4℃，1000 g 离心 10 分钟然后重悬浮，典型的制备量为 10 ml 新鲜培养基含 108 个细胞。 3. 将浓的细胞悬液在冰上放置至少 30 分钟冷却以帮助有丝分裂复合物的完全解离。 4. 4℃ 1000 r/min 离心 10 分钟沉淀细胞。 5. 沉淀用 10 ml 75 mmol/L

1. 按聚胺法第 1 和 2 步中所述诱导 500 ml 悬浮或单层培养细胞为中期阻遏状态。 2. 细胞在 4℃ 1000 r/min 离心 10 分钟，用 10 ml 培养基重悬浮。 3. 将重悬浮的细胞冷却至 4℃ 放置 20 分钟。 4. 细胞在 4℃ 1000 r/min 离心 4 分钟，取出培养基。 5. 在 4℃ 用己二醇缓冲液清洗细胞，按第 4 步进行离心。 己二醇缓冲液：

1. 准备两种 18ml，浓度分别为 20% 和 60% 的蔗糖分离缓冲液（聚胺，水相或己二醇法的缓冲液），然后以线性形式加到一 50 ml 的聚碳酸酯离心管中，用梯度生成器形成沿离心管的密度梯度。 2. 将染色质粗品溶液轻轻地加到梯度上，用带吊桶式转头的 JS-13 ( Beckman Instruments ) 或 HB-4 ( Sorvall) 离心机在 2500 g 离心 15 分钟。

1. 在体积为 10 ml 分离得到的染色质物质中加入精胺和精咪至终浓度分別为 0.8 mmol/L 和 2 mmol/L。 2. 加入 10 ml Percoll 溶液，匀浆分离得到的染色质。 Percoll 溶液： 89% (v/v) Percoll 5 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) 2 mmol/L EDTA 0.8 mmol/L 精胺 2 mmol/L

1. 准备 5 份 6 ml 的 10%、20%、30%、40%、50%（v/v）甘油/染色质分离缓冲液溶液。 2. 用 JS-13 转桶式转头在 4℃，1000 r/min 离心 50 分钟进行染色质梯度沉降。 3. 以 3 ml —份收集梯度顶部组分。 4. 每一组分固定少量样品（10~20 ml）于载玻片上，用相差显微镜观察确定含染色体的组分。 5. 收集含有纯化的染色体的样品。